抑郁癥是一種嚴(yán)重影響人類心理功能和生活質(zhì)量的疾病,其發(fā)病率逐年上升,已經(jīng)逐漸成為全球性的健康難題。由于目前在臨床運(yùn)用的抗抑郁藥物仍存在許多不足,開發(fā)新型抗抑郁藥物一直以來都是研究的熱點(diǎn)。木豆素(Cajaninstilbene acid,CSA)是存在于木豆[Cajanus cajan(Linn.)Millsp.]葉中的一種苗類化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗菌等藥理作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,CSA具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用,能夠通過抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡等途徑保護(hù)神經(jīng)元,具有潛在的抗抑郁活性。而目前還沒有研究對CSA的抗抑郁效應(yīng)進(jìn)行考察和報(bào)道。因此,本文首次通過抑郁動(dòng)物模型和行為學(xué)檢測評價(jià)CSA的抗抑郁作用,并結(jié)合抑郁癥的病理機(jī)制假說,從下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸、神經(jīng)遞質(zhì)、色氨酸(tryptophan,TRP)代謝和突觸可塑性這幾個(gè)方面對CSA可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。以期發(fā)現(xiàn)一種可以有效防治抑郁癥的候選化合物,從而進(jìn)一步開發(fā)成為抗抑郁新藥。具體研究內(nèi)容如下:1.CSA對行為絕望模型小鼠的抗抑郁作用及CSA急性毒性研究。連續(xù)7天口服給予雄性BALB/c小鼠CSA后進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,CSA在30mg/kg劑量下可以顯著縮短懸尾實(shí)驗(yàn)小鼠的不動(dòng)時(shí)間;CSA在30、60mg/kg劑量下可以顯著縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間。該結(jié)果提示CSA在一定劑量下具有抗抑郁作用。急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示,CSA 口服給藥的半數(shù)致死量LD50為674.5 mg/kg,95%可信區(qū)間為572.8～798.2 mg/kg,屬低毒。2.CSA 對慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型小鼠的抗抑郁作用。對雄性BALB/c小鼠進(jìn)行CUMS造模,通過體重、糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、空場實(shí)驗(yàn)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)檢測進(jìn)一步探究CSA的抗抑郁作用。結(jié)果顯示,CUMS應(yīng)激引起了小鼠的抑郁樣行為,包括糖水偏愛指數(shù)下降,新奇抑制攝食潛伏期延長,懸尾不動(dòng)時(shí)間延長。CSA15、30 mg/kg可以顯著升高模型小鼠的糖水偏愛指數(shù),有效減少新奇抑制攝食潛伏期,CSA30mg/kg可顯著減少CUMS小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間并增加其做功數(shù),提示CSA具有抗抑郁作用。而體重測試、空場實(shí)驗(yàn)表明CSA對于小鼠的體重和自主活動(dòng)沒有顯著影響。與正常組相比,模型組動(dòng)物的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無明顯延長,且給藥后動(dòng)物的不動(dòng)時(shí)間也無明顯改變。3.CSA對CUMS模型小鼠血清皮質(zhì)酮水平的影響。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測的方法測定動(dòng)物血清內(nèi)皮質(zhì)酮的含量。結(jié)果表明,CUMS造模引起了小鼠血清內(nèi)皮質(zhì)酮水平的顯著升高,而給予CSA15mg/kg后可以顯著減少CUMS小鼠血清皮質(zhì)酮的水平,說明CSA可能通過抑制HPA軸功能而產(chǎn)生抗抑郁作用。4.CSA對CUMS模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。通過LC-MS/MS法檢測小鼠皮層和海馬組織中神經(jīng)遞質(zhì)的含量。結(jié)果表明,與正常組比較,CUMS小鼠皮層中多巴胺(dopamine,DA)、去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)、谷氨酸(glutamate,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)含量顯著減少。CSA7.5mg/kg 可以顯著提高CUMS小鼠皮層中NE、Glu和GABA的含量,CSA 15 mg/kg可以顯著提高CUMS小鼠皮層中NE、Glu和DA的含量,而CSA 30 mg/kg可顯著提高CUMS小鼠皮層中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量。與正常組比較,CUMS小鼠海馬中乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)含量顯著減少且CSA7.5mg/kg、15mg/kg可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢。綜上說明,CSA可能通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)水平進(jìn)而產(chǎn)生抗抑郁活性。5.CSA對CUMS模型小鼠TRP代謝的影響。通過LC-MS/MS法檢測小鼠皮層、海馬和血清中TRP代謝物的水平,包括TRP、5-HT、犬尿氨酸(Kynurenine,KYN)、犬尿喹啉酸(Kynurenic acid,KYNA)、3-羥基犬尿氨酸(3-Hydroxykynurenine,3-HK)和 5-羥吲哚乙酸(5-Hydroxyindoleaceticacid,5-HIAA)。結(jié)果表明,與正常組相比,模型組皮層中TRP、KYNA含量顯著減少。CSA7.5mg/kg和15mg/kg可顯著提高皮層內(nèi)KYNA含量,而CSA30mg/kg可顯著提高皮層內(nèi)5-HT含量。與正常組相比,模型組海馬中KYN含量顯著升高。但帕羅西汀、CSA均未顯著改變CUMS小鼠海馬內(nèi)TRP及其代謝物的水平。與正常組相比,模型組小鼠血清中5-HT、KYNA含量顯著減少,KYN含量顯著增加。帕羅西汀、CSA7.5 mg/kg可顯著降低模型小鼠血清中KYN含量,CSA 30 mg/kg可顯著提高模型小鼠血清內(nèi)KYNA的含量。說明CSA抗抑郁作用的產(chǎn)生可能與其能夠調(diào)節(jié)TRP代謝有關(guān)。6.CSA對CUMS模型小鼠皮層內(nèi)突觸可塑性相關(guān)蛋白及通路的影響。采用Western Blot方法觀察小鼠皮層內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明,CUMS應(yīng)激能顯著降低小鼠皮層內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brainderivedneurophic factor,BDNF)、原肌球蛋白受體相關(guān)激酶B(Tropomyosin receptor-related kinase B,TrkB)和突觸后致密蛋白-95(Postsynapticdensityprotein-95,PSD-95)的水平,并且抑制蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化,而這些改變均可被CSA所逆轉(zhuǎn)。說明CSA可能通過上調(diào)BDNF/TrkB和Akt/mTOR通路,促進(jìn)CUMS小鼠皮層內(nèi)突觸后蛋白的合成來促進(jìn)突觸可塑性,并最終產(chǎn)生抗抑郁作用。7.基于腦微透析技術(shù)探究木豆素對大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC)細(xì)胞間液神經(jīng)遞質(zhì)和色氨酸代謝物水平的影響。采用正常雄性SD大鼠及CUMS雄性SD大鼠通過腦微透析技術(shù)動(dòng)態(tài)收集CSA給藥后6 h內(nèi)清醒大鼠mPFC中的微透析樣品,LC-MS/MS法檢測其中神經(jīng)遞質(zhì)和TRP代謝物的水平。結(jié)果表明CSA可以提高正常清醒大鼠mPFC細(xì)胞間液中NE、Glu和ACh的水平,降低KYN的水平。對于CUMS大鼠,CSA可以提高其mPFC細(xì)胞間液中KYNA的水平,并降低5-HIAA以及KYN的含量。說明CSA能夠快速地調(diào)節(jié)mPFC細(xì)胞間液中的神經(jīng)遞質(zhì)水平和TRP代謝。以上結(jié)果提示,CSA能有效改善甚至消除抑郁模型動(dòng)物所表現(xiàn)出的抑郁樣行為,并可能通過調(diào)節(jié)HPA軸、神經(jīng)遞質(zhì)水平、TRP代謝及突觸可塑性相關(guān)蛋白和通路產(chǎn)生抗抑郁作用。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

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．．動(dòng)物適應(yīng)性詞養(yǎng)１周后進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)（見本節(jié)“１．５．２”項(xiàng)下），根據(jù)此糖水逡逑偏愛實(shí)驗(yàn)結(jié)果將小鼠隨機(jī)分為６組，每組１２只，即正常組、ＣＵＭＳ模型組、帕羅逡逑西汀組邋ＵＯｍｇ／ｋｇ）、ＣＳＡ邋低劑量組（７．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＳＡ邋中劑量組（１５ｍｇ／ｋｇ）、ＣＳＡ逡逑高劑量組（３０ｍｇ／ｋｇ）。除正常組外，其余各組動(dòng)物單籠飼養(yǎng)且在６周內(nèi)接受ＣＵＭＳ逡逑造模，應(yīng)激因素包括：禁水（１２邋ｈ）、禁食（１２邋ｈ）、晝夜顛倒（２４邋ｈ）、夾尾（２邋￣邋３逡逑ｍｉｎ）、４°Ｃ冰水游泳（５ｍｉｎ）、動(dòng)物叫聲（３０ｍｉｎ）、束縛（４ｈ）、濕籠（３００ｍＬ水逡逑／籠，１０ｈ）、４５°Ｃ傾籠（７ｈ）、配對詞養(yǎng)（１２ｈ）等。每日應(yīng)激刺激２？３種，并盡逡逑量滿足不可預(yù)測的特性，以避免動(dòng)物對應(yīng)激模式產(chǎn)生適應(yīng)。給予動(dòng)物ＣＵＭＳ應(yīng)激同逡逑時(shí)開始給藥，直到檢測結(jié)束，每日１次。各組動(dòng)物均以１０ｍＬ／ｋｇ灌胃給藥。藥物均逡逑以０．５％羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑，正常組和模型組動(dòng)物給予溶劑。實(shí)驗(yàn)流程見逡逑圖１－５，具體的應(yīng)激因素方案見表１－１。逡逑

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