第一部分蓮房原花青素對阿爾茲海默疾病細胞模型的保護作用目的:探索蓮房原花青素對阿爾茲海默疾病的保護作用。本研究以β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)干預大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(Pheochromocytomacells 12,PC12)構(gòu)建阿爾茲海默疾病(Alzheimer's disease,AD)細胞模型,再通過蓮房原花青素(Procyanidins from the lotus seedpod,LSPC)干預AD細胞模型探索LSPC對于AD細胞模型的保護作用。方法:(1)Aβ干預時間以及劑量的確定將PC12細胞接種于96孔板,將0、5、10、20及40μM不同濃度Aβ25-35,按照6、12、24、48、72h不同干預時間分別干預細胞,將0μMAβ25-35組設置為對照組。通過CCK-8實驗求得細胞存活率,根據(jù)細胞存活率選擇最合適的Aβ干預時間以及劑量。(2)LSPC干預劑量的確定確定Aβ干預時間以及劑量后,再通過CCK-8實驗確定LSPC干預劑量。將PC12細胞接種于96孔板,將1、2.5、5、10、20及40μg/mL不同濃度的LSPC加入細胞中,預處理30min后加入Aβ25-35,并設置空白對照組和Aβ組。通過CCK-8實驗求得細胞存活率,根據(jù)細胞存活率確定LSPC干預劑量。(3)蓮房原花青素對AD細胞模型的保護作用將PC12細胞分為3組:對照組、Aβ組(20μMAβ干預PC12細胞24h)以及LSPC干預組(10μg/mL LSPC預處理PC12細胞30 min后用20μM Aβ干預PC12細胞24h)。干預完成后,通過倒置顯微鏡觀察和Hoechst染色觀察細胞形態(tài)學變化;然后使用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,以觀察LSPC對AD細胞模型的保護作用。結(jié)果:(1)根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果顯示在5μM Aβ25-35對細胞存活率無顯著影響,10μMAβ25-35作用下干預時間越長細胞存活率越低;20μMAβ25-35作用24h后,細胞存活率出現(xiàn)明顯下降(P0.05),之后細胞存活率不隨干預時間增加而下降;而40μM Aβ25-35干預12 h后細胞存活率一直低于50%。因此選用20μM作為Aβ暴露劑量,24 h作為Aβ干預時間。(2)由20μM Aβ干預引起的細胞凋亡在LSPC劑量由低到10μg/mL.的過程中逐漸降低,當LSPC到達10μg/mL時,細胞存活率顯著增加(0.05),且PC12細胞存活率此后不再隨LSPC劑量增加而明顯增加。結(jié)果表明10μg/mLLSPC對AD細胞模型保護效果明顯,因此選擇10μg/mL作為LSPC的干預劑量。(3)倒置顯微鏡下Aβ組細胞數(shù)目明顯減少,細胞形態(tài)變化明顯,而對照組和LSPC組結(jié)果相似。Hoechst染色顯示Aβ組可見大量凋亡細胞和核固縮現(xiàn)象,而LSPC組處理后凋亡細胞數(shù)量減少,核固縮現(xiàn)象亦減少。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示對照組總凋亡率(Q2+Q3)5%,Aβ組細胞總凋亡率達到33.36%(P0.05),而LSPC組比Aβ組細胞凋亡率顯著降低(P0.05)。結(jié)論:LSPC可改善AD細胞模型中的細胞形態(tài)改變及細胞凋亡現(xiàn)象,說明LSPC對于AD具有保護作用。第二部分蓮房原花青素在動物體內(nèi)的代謝分布目的:通過LC-MS/MS探索LSPC在動物體內(nèi)的代謝及分布,以發(fā)現(xiàn)LSPC中對AD起到保護作用的有效成分。方法:(1)實驗動物的喂養(yǎng)將SPF級3月齡的SD大鼠一共14只,分為2組,每組7只,喂養(yǎng)2周。對照組每天根據(jù)大鼠體重灌胃1mL/kg生理鹽水,蓮房原花青素干預組每天根據(jù)體重200 mg/kg灌胃20 mg/mL的LSPC溶液。第14 d大鼠斷頭后,分離并保留各組織和血漿。LC-MS/MS實驗前,稱取60 mg凍存組織樣本溶于勻漿器中,充分勻漿并放置-80℃保存,至測試時取出。(2)實驗樣本準備將標準品配制濃度梯度為0.5、1、2、5、10、20、40、50、80、100ng/mL的標準曲線。將樣本取出50μL加入50μLβ-葡萄糖醛酸酶溶液(1500U/mL),pH調(diào)節(jié)至5,震蕩30 s,37℃水浴2 h。向樣本加入20μL內(nèi)標溶液,再加入300μL乙酸乙酯溶液,震蕩離心后,取出上清液放入另一 EP管中,再向剩余溶液中加入300μL乙酸乙酯溶液,并重復以上步驟。上清液放置在35℃空干燥,加入50μL復溶液,并在室溫下靜置后離心。將EP管中45μL上清溶液取出放入測試瓶中以備測定。(3)LC-MS/MS實驗條件我們使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(LC-MS/MS,AB Sciex Q-Traβ 4500,Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)進行樣品分析。流動相由水相(A)0.2%(v/v)乙酸/水,以及有機相(B)0.2%(v/v)乙酸/甲醇組成,進樣量為5μL。質(zhì)譜離子源采用電離子噴霧(electrospray ionization,ESI)源,采用負離子檢測模式,并通過LC-MS/MS對各物質(zhì)母離子子離子對、碰撞能等進行了篩選。然后使用質(zhì)譜多反應檢測(Multiple reaction monitoring,MRM)模式對各種物質(zhì)進行掃描和定性,并通過標準曲線對物質(zhì)進行定量分析。結(jié)果:(1)在腦組織中對比于對照組動物,LSPC組動物海馬中槲皮素(P0.01)、表兒茶素(P0.001)、香草酸(P0.05)、對羥基苯丙酸(P0.05)、沒食子酸(P0.01)、3-羥基苯乙酸(3-Hydroxyphenylacetic acid,3-HPAA)(P0.05)均有顯著增加。而槲皮素(P0.01)、表兒茶素(P0.001)、香草酸(P0.05)、對羥基苯丙酸(P0.05)、阿魏酸(P0.05)、咖啡酸(P0.01)、間香豆酸(P0.001)、3,4-二羥基苯甲酸(P0.001)在LSPC組皮質(zhì)中顯著增加。對比對照組與LSPC組動物小腦后,發(fā)現(xiàn)槲皮素(P0.01)、沒食子酸(P0.05)、對羥基苯丙酸(P0.001)、間香豆酸(P0.05)、3-羥基苯乙酸(P0.01)、間羥基苯甲酸(3-Hydroxybenzonic acid,3-HBA)(P0.05)在 LSPC 組中增加明顯。(2)LSPC組動物肝臟和心臟組織中,槲皮素、表兒茶素、咖啡酸和3-羥基苯乙酸均有顯著增加(P0.05);兒茶素在心臟組織中增加;肝臟組織中3-羥基-4-甲氧基苯乙酸(Homovanillicacid,HVA)、沒食子酸、間羥基苯甲酸增加顯著(P0.05)。在腎臟組織中槲皮素(P0.001),兒茶素(P0.01),表兒茶素(P0.001),HVA(P0.001),咖啡酸(P0.01),香草酸(P0.05),3,4-二羥基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylaceticacid,3,4-DHPA)(P0.01),3-HBA(P0.001)和鄰苯二酚(0.01)顯著增加。LSPC組動物胰腺中槲皮素(0.001),阿魏酸(P0.05),沒食子酸(P0.05)和間香豆酸(P0.01)增加顯著。槲皮素(P0.05)和3,4-DHPA(P0.01)在LSPC組脾臟中檢出顯著增加。而在腸道內(nèi)容物中,除阿魏酸外,各物質(zhì)均有增加。(3)對比對照組,LSPC組動物血漿中槲皮素(P0.05)、表兒茶素(P0.05)、丁香酸(P0.001)、阿魏酸(P0.01)、HVA(P0.001)、咖啡酸(0.01)、香草酸(P0.001)、p-HPPA(P0.001)、間香豆酸(P0.05)、PCC(P0.01)、3-HBA(P0.001)、鄰苯二酚(P0.01)均顯著增加。結(jié)論:LSPC干預后多種成分在動物體內(nèi)增加,且不同組織和血漿中的物質(zhì)含量和形式各不相同。而LSPC干預后槲皮素在體內(nèi)各個組織中的增加是由于LSPC中槲皮素葡萄糖酸苷(Quercetin-3-O-glucuronide,Q3G)所致。結(jié)合本研究結(jié)果及已有關(guān)于Q3G生物作用的研究報道,因此推測Q3G可能是LSPC對AD起保護作用的有效成分。第三部分蓮房原花青素對阿爾茲海默疾病的改善作用及相關(guān)機制研究目的:本研究第三部分研究主要是通過AD動物模型驗證LSPC中Q3G是否具有改善AD動物學習和記憶能力,并探索Q3G作用的主要通路。方法:(1)將36只C57小鼠分為三組,分別為對照組、AD組及干預組,每組各12只。三組通過側(cè)腦室立體定位分別注射生理鹽水、老化Aβ1-42以及老化Aβ1-42。術(shù)后對照組和AD組小鼠每天按照20μg/mL體重給予雙蒸水,而干預組小鼠每天按照50 mg/kg體重給予用雙蒸水溶解的Q3G懸濁液,灌胃30 d,并記錄小鼠體重和進食量。(2)小鼠禁食6 h后進行腹腔注射糖耐量測試,并于1周后進行腹腔注射胰島素耐量測試。干預結(jié)束后,小鼠先進行為期各1d的曠場實驗和十字高架,之后進行為期7d的水迷宮實驗,測定小鼠學習和記憶能力情況。實驗結(jié)束后,將小鼠處死并分離保存小鼠海馬及皮層。(3)通過ELISA分別測定小鼠腦組織Aβ含量以及腹腔注射糖耐量實驗收集血漿中胰島素含量。通過HE染色鑒別小鼠腦組織內(nèi)細胞壞死和細胞凋亡的情況。通過免疫印跡的方法來檢測小鼠腦組織內(nèi)各蛋白含量及磷酸化情況,并結(jié)合免疫組化對相關(guān)蛋白進行定位、定性及定量研究。結(jié)果:(1)水迷宮實驗結(jié)果顯示AD組小鼠比對照組學習和記憶能力顯著降低(P0.05),而干預組小鼠明顯改善小鼠的學習和記憶能力(P0.05)。曠場實驗及十字高架實驗證明Aβ及干預Q3G并未導致小鼠自發(fā)活動和焦慮樣情緒的改變。(2)腹腔注射糖耐量測試結(jié)果表明AD組小鼠血糖代謝與對照組組小鼠有顯著差異(P0.05),Q3G可改善Aβ引起的小鼠胰島素抵抗狀態(tài)(P0.05)。但是腹腔注射胰島素耐量測試中三組在胰島素分泌并無差異,且腹腔注射胰島素耐量測試三組間亦無明顯差異。(3)ELISA以及免疫組化結(jié)果顯示AD組小鼠比對照組小鼠腦組織內(nèi)Aβ含量明顯增加(P0.05),而Q3G可顯著降低Aβ在腦組織內(nèi)含量(P0.05)。HE染色結(jié)果表明AD組腦組織內(nèi)細胞壞死和凋亡比對照組顯著增加,而Q3G可緩解由Aβ引起的細胞壞死和凋亡。免疫印跡和免疫組化發(fā)現(xiàn),與對照組相比,AD組Tau蛋白磷酸化水平顯著升高,PKR及JNK蛋白磷酸化顯著增多,IRS-1絲氨酸化增加,Akt和ERK磷酸化降低,且GSK蛋白磷酸化水平下降。而Q3G可改善由Aβ導致的小鼠腦組織內(nèi)胰島素抵抗,通過降低PKR及JNK蛋白磷酸化水平,減少IRS-1絲氨酸化,提升Akt和ERK磷酸化水平,從而增加GSK蛋白磷酸化水平,降低Tau磷酸化水平。結(jié)論:LSPC中Q3G可通過改善AD模型小鼠胰島素抵抗,調(diào)節(jié)IRS-1絲氨酸化,從而提高小鼠的學習和記憶能力,因此Q3G可能是LSPC中改善阿爾茲海默疾病的有效成分。本研究為預防與治療提供新的思路和方案。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5

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