前言骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種全世界范圍內(nèi)影響患者疼痛和功能的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,隨著年齡增加其發(fā)病率也不斷上升,對我國的醫(yī)療、經(jīng)濟和社會造成了嚴重負擔。骨關(guān)節(jié)炎的病理變化主要有以下幾點:(1)軟骨細胞出現(xiàn)凋亡、(2)軟骨基質(zhì)遭到破壞、(3)軟骨下骨骨化、骨贅形成、(4)滑膜產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。其發(fā)病機制迄今為止尚未明確,因而限制了骨關(guān)節(jié)炎的治療手段。早期骨關(guān)節(jié)炎以口服藥物為主,如非甾體抗炎藥(NSAIDs),但NSAIDs類藥物因?qū)ξ改c道及心血管具有一定的毒副作用,對患者的身體健康具有隱患,因而影響了其在骨關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用。槲皮素(Quercetin,QUE),是一種廣泛存在于植物界中的五羥基黃酮類化合物,具有較高的藥用價值。近來大量研究發(fā)現(xiàn),槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡、清除氧自由基、抑制破骨細胞吸收以及免疫調(diào)節(jié)等活性作用。目前槲皮素的研究在腫瘤領(lǐng)域開展較為廣泛,而其對軟骨細胞影響的報道尚不多見。因此我們想通過本實驗,來研究槲皮素在骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程中,是否能夠抑制軟骨細胞凋亡,影響相應(yīng)細胞因子表達水平,從而起到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。本研究主要分體外實驗及體內(nèi)實驗兩大部分:一、首先體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞,加入白細胞介素-1β(IL-1β)引起細胞凋亡,并在實驗組中一同加入不同濃度槲皮素進行干預(yù),檢測軟骨細胞凋亡率,以及軟骨細胞中Bc1-2及Bax、Caspase-9基因表達差異,并進一步分析檢測Bcl-2蛋白及Bax蛋白、Caspase-9蛋白和Caspase-3蛋白的表達情況。研究結(jié)果顯示,當槲皮素達到一定濃度時可以起到抑制IL-1β介導(dǎo)軟骨細胞凋亡的作用。通過增加抗凋亡Bcl-2基因及Bcl-2蛋白的表達,抑制促凋亡Bax基因及Bax蛋白、Caspase-9蛋白和Caspase-3蛋白的表達起到保護軟骨的作用。二、在關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的OA動物模型中,向大鼠灌胃不同濃度的槲皮素懸液,4周后檢測膝關(guān)節(jié)腫脹程度、組織學(xué)表現(xiàn)及血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1β濃度水平來了解槲皮素對骨關(guān)節(jié)炎的作用。結(jié)果提示一定濃度的槲皮素可減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷,緩解關(guān)節(jié)腫脹,抑制血清中TNF-α和IL-1β炎性因子的表達,從而起到治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。因此我們得出結(jié)論,槲皮素可以對關(guān)節(jié)軟骨起到保護作用,其主要機制為通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因及蛋白表達抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。第一部分 槲皮素對白介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞凋亡的保護作用目的:觀察槲皮素對軟骨細胞凋亡(由白細胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo))的影響及相關(guān)致病機制的分析。方法:隨機法將從正常大鼠關(guān)節(jié)分離獲取的軟骨細胞分成5組,分別為對照組(不加任何干預(yù))、IL-1β組(IL-1β 50μg/mL,作用24h)和3個不同濃度的槲皮素組(100μM、200μM、400μM-槲皮素+IL-1β,共同作用24h)。各組軟骨細胞均在孔板中孵育,實驗重復(fù)三次。通過流式細胞儀計算各組細胞的凋亡率,采用PCR和Western blot方法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-9的相對表達水平,Western blot分析Caspase-3的相對表達水平。結(jié)果:與對照組相比,其他4組軟骨細胞凋亡率均顯著增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。PCR得到結(jié)果顯示促凋亡Bax基因和Caspase-9基因表達均顯著升高,而抗凋亡Bcl-2基因表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot分析同樣表明Bax蛋白和Caspase-9蛋白表達均顯著升高,而Bcl-2蛋白表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與IL-1β組相比,高濃度槲皮素組(400μM)軟骨細胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。PCR結(jié)果顯示促凋亡Bax基因和Caspase-9基因表達均顯著降低,而抗凋亡Bcl-2基因表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot分析結(jié)果表明Bcl-2蛋白表達明顯增高,而Bax蛋白和Caspase-9蛋白及Caspase-3裂解蛋白表達均顯著降低(P0.05)。結(jié)論:槲皮素能降低Bax的表達,增加Bcl-2的表達,同時降低Caspase-9及Caspase-3的表達,從而起到抑制IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡的作用。第二部分 槲皮素對大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的治療作用目的:關(guān)節(jié)腔注射法建立大鼠OA動物模型后,灌胃飼養(yǎng)后觀察指標以探討不同濃度槲皮素對骨關(guān)節(jié)炎的保護作用。方法:48只的雄性SD大鼠隨機均分為空白組(正常、不做干預(yù))、模型對照組、阿司匹林陽性對照組、低劑量槲皮素組、中劑量槲皮素組和高劑量槲皮素組。除外空白組的8只大鼠,其余40只大鼠進行向右膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白制作OA模型。建模4周后,造模組每日灌胃以不同的藥物溶液各4mL。分別為:模型對照組:0.9%生理鹽水灌胃4mL/日;阿司匹林陽性對照組:濃度為5mg/mL的阿司匹林溶液灌胃4mL/日;低劑量槲皮素組:濃度為2.5mg/mL的槲皮素懸液灌胃4mL/日;中劑量槲皮素組:濃度為5mg/mL的榭皮素懸液灌胃4mL/日;高劑量槲皮素組:濃度為10mg/mL的槲皮素懸液灌胃4mL/日。持續(xù)4周。末次灌胃后第2日測量大鼠右膝關(guān)節(jié)直徑、取膝關(guān)節(jié)組織進行組織學(xué)制片、ELISA法檢測血清炎性細胞因子TNF-α及IL-1β水平。結(jié)果:與空白組對比,模型組及3組槲皮素組的大鼠右膝關(guān)節(jié)直徑均顯著增大,有顯著性差異(P0.05);模型組及中、低濃度槲皮素組血清中TNF-α及IL-1β顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與模型組比較,高劑量槲皮素組和阿司匹林陽性對照組的大鼠膝關(guān)節(jié)直徑顯著減小,且具有更低的組織學(xué)評分,具有顯著性差異(P0.05);通過ELISA法,高劑量槲皮素組和阿司匹林陽性對照組血清中TNF-α及IL-1β水平較模型組明顯下降,中劑量槲皮素組血清中IL-1β水平也較模型組明顯降低,均具有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:槲皮素能通過降低炎癥因子的表達,在OA動物模型實驗中起到對保護關(guān)節(jié)軟骨的作用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐正文第一部分實驗結(jié)果逡逑１．４實驗結(jié)果逡逑１．４．１大鼠軟骨細胞培養(yǎng)結(jié)果觀測逡逑大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨姐織經(jīng)消化分離原代細胞，培育１０－１４天后形成８０－９０％的細逡逑胞融合。分別使用Ａｌｃｉａｎ邋ｂｌｕｅ染色和ＩＩ型膠原染色進行觀察和確定。（圖１－１）逡逑

４００｜ａＭ濃度的槲皮素處理后的大鼠軟骨細胞凋亡率較其明顯下降，且逡逑兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ｐ＜0．0５）；而ｌＯＯｐＭ和２００ｐＭ濃度的槲皮素處理后的軟骨逡逑細胞凋亡率雖均低于ＩＬ－ｉｐ組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ｐ＞０．０邋５）。（圖１－３）逡逑２０逡逑

通過ＴＵＮＥＬ染色法在熒光顯微鏡下觀測軟骨細胞的凋亡情況，可以更直觀逡逑的進一步驗證表明：與對照俎相比，ＩＬ－ｌｐ可以明顯增加軟骨細胞凋亡，而槲皮逡逑素可以有效的減少丨Ｌ－ｉｐ誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡。（圖１－４）逡逑ｑｉＫＴｃｖｔｉｉＵｊｉＭ）逡逑Ｃｃｔｔｉｒｏｌ邐ＩＵＩ｜ｌ邐１００邐２００邐１００逡逑■■■■■逡逑■■■ＨＵＢ逡逑圖１－４邋ＴＵＮＥＬ染色法檢測軟骨細胞凋亡結(jié)果逡逑１．４．３邋槲皮素降低邋Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ邋９邋ｍＲＮＡ邋表徸，增加邋Ｂｃｌ－２邋ｍＲＮＡ逡逑表達逡逑ＰＣＲ結(jié)果揭示了調(diào)亡基因Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ９ｍＲＮＡ以及抗調(diào)亡基因Ｂｃｌ－２逡逑ｍＲＮＡ表達水平，我們通過以（３－ａｃｔｉｎ為內(nèi)參照，將（３－ａｃｔｉｎ基因的相對表達率設(shè)逡逑２１逡逑

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本文編號：2822764