疼痛是一種不適的感覺(jué)和情緒體驗(yàn),伴隨潛在的或?qū)嶋H性的組織損傷,疼痛持續(xù)或間歇性地持續(xù)3個(gè)月以上則定義為慢性疼痛。慢性疼痛尤其是神經(jīng)病理性疼痛病程長(zhǎng),容易誘發(fā)各種并發(fā)癥;此外,患者較易患失眠、焦慮、抑郁等亞健康問(wèn)題,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。然而,目前治療慢性疼痛的藥物多數(shù)存在不同程度的副反應(yīng),超過(guò)半數(shù)患者對(duì)藥物的鎮(zhèn)痛效果不滿。細(xì)辛始載于東漢末年《神農(nóng)本草經(jīng)》,為臨床常用中藥,廣泛用于治療頭痛,齒痛、鼻淵、三叉神經(jīng)痛以及風(fēng)濕痹痛等。研究報(bào)道,細(xì)辛揮發(fā)油類(lèi)成分、水煎劑均具有較好的鎮(zhèn)痛作用。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1),作為T(mén)RP家族中的一員,被定義為疼痛門(mén)控分子,是治療慢性疼痛的有效靶點(diǎn)之一,在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)細(xì)辛的鎮(zhèn)痛作用,本文通過(guò)多種急慢性疼痛行為對(duì)細(xì)辛水提液和指標(biāo)性成分細(xì)辛脂素(Asarinin)的鎮(zhèn)痛活性開(kāi)展了系統(tǒng)評(píng)價(jià),并建立小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型(chronic constriction injury,CCI),基于TRPV1的表達(dá)與功能變化探討了細(xì)辛鎮(zhèn)痛機(jī)制。目的:多種急慢性疼痛模型評(píng)價(jià)細(xì)辛水提液和細(xì)辛脂素的鎮(zhèn)痛活性;基于TRPV1的表達(dá)與功能,在神經(jīng)病理性疼痛模型水平研究細(xì)辛水提液的鎮(zhèn)痛機(jī)制。方法:(1)浸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)辛水提液對(duì)傷害性熱刺激引起疼痛行為的影響,確定最佳鎮(zhèn)痛時(shí)間和濃度。隨機(jī)選取6-8周大小的雄性C57BL/6小鼠,每組8只,細(xì)辛水提液(32 mg/kg)灌胃處理,記錄灌胃后0、1、2、3、4、5h的48℃水浴浸尾實(shí)驗(yàn)甩尾時(shí)間,確定最佳鎮(zhèn)痛時(shí)間。分別灌胃給予5.3mg/kg、32mg/kg、192 mg/kg細(xì)辛水提液,并記錄灌胃2h后浸尾實(shí)驗(yàn)甩尾時(shí)間,確定最佳鎮(zhèn)痛濃度。(2)熱輻照和VonFrey實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)辛水提液對(duì)傷害性熱刺激和機(jī)械刺激引起疼痛行為的影響。將16只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和WA組(32mg/kg),分別給予純水和WA灌胃2h后,測(cè)量小鼠機(jī)械縮足閾值(MWT)和熱縮足反射潛伏期(TWL)。(3)評(píng)價(jià)細(xì)辛水提液對(duì)辣椒素、甲醛刺激引起的疼痛行為的影響。辣椒素急性致痛實(shí)驗(yàn):對(duì)照組(純水灌胃)、WA組(32mg/kg);1%福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn):對(duì)照組(純水灌胃)、WA組(32mg/kg),每組隨機(jī)選取6只雄性小鼠。灌胃2h后在小鼠右腳掌分別注射辣椒素(500μM/10μL/mouse)和1%的福爾馬林(1OμL/mouse),注射辣椒素組錄像30min,福爾馬林組1h,并統(tǒng)計(jì)小鼠抬腳的次數(shù)和舔腳時(shí)間。(4)評(píng)價(jià)細(xì)辛水提液對(duì)神經(jīng)病理性疼痛引起的痛覺(jué)敏化的影響。隨機(jī)分組,每組13只雄性小鼠,共6組。分別為:空白組、假手術(shù)組、坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型組(CCI)、細(xì)辛水提液低劑量組(WA-L)、細(xì)辛水提液高劑量組(WA-H)、加巴噴丁組(GBPT)。CCI模型建立5天觀察到明顯疼痛行為后開(kāi)始給予藥物灌胃處理:空白組和假手術(shù)組以及CCI組給予純水;WA-L組:32mg/kg/day細(xì)辛水提液灌胃;WA-H組:96mg/kg/day細(xì)辛水提液灌胃;GBPT組:0.2 g/kg/day加巴噴丁灌胃,每天給藥一次,持續(xù)給藥9天。測(cè)量6組小鼠的體重,并于第0、1、3、5、7、9、11、13天測(cè)得機(jī)械縮足閾值和熱縮足反射潛伏期。(5)基于TRPV1的功能與表達(dá)活性,探索細(xì)辛水提液抑制神經(jīng)病理性疼痛引起的痛覺(jué)敏化的機(jī)制。第14天灌胃2h后取小鼠L4-L6及骶部的DRG,借助鈣離子成像技術(shù)觀察各組小鼠DRG神經(jīng)元TRPV1生理活性的變化。取小鼠腰L4-L6及骶部的DRG,借助免疫熒光染色、實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)觀察各組小鼠TRPV1表達(dá)活性變化。(6)細(xì)辛脂素是細(xì)辛的指標(biāo)性化學(xué)成分,探討細(xì)辛脂素對(duì)傷害性熱刺激和傷害性機(jī)械刺激引起疼痛行為的影響。每組6只雄性小鼠,分為對(duì)照組和Asarinin-L組(0.8mg/kg)、Asarinin-M組(2.5mg/kg)和Asarinin-H組(7.5mg/kg),小鼠右側(cè)腳掌皮下注射Asarinin(10μL/mouse)30min后,測(cè)量MWT和TWL。(7)評(píng)價(jià)細(xì)辛脂素對(duì)炎性痛誘導(dǎo)的痛覺(jué)敏化的影響。分為對(duì)照組(Saline+1%乙醇)、Asarinin-L組(8mg/kg)、Asarinin-M組(25mg/kg)和Asarinin-H組(75mg/kg),每組8只小鼠。完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)的炎性痛模型第2天分別灌胃給藥,選取0.4g、0.07g的力度刺激小鼠右側(cè)腳掌10次,統(tǒng)計(jì)給藥1h、2h后每個(gè)力度刺激下小鼠抬腳的比例,并測(cè)量TWL。結(jié)果:(1)細(xì)辛水提液灌胃后可抑制傷害性熱刺激引起的疼痛長(zhǎng)達(dá)5h,并在給藥2h后鎮(zhèn)痛效果最佳。細(xì)辛水提液抑制傷害性熱刺激引起的疼痛具有劑量依賴性,32mg/kg的濃度下鎮(zhèn)痛效果可達(dá)到最佳。(2)熱輻照和VonFrey實(shí)驗(yàn)表明:細(xì)辛水提液明顯抑制傷害性熱刺激和機(jī)械刺激引起的疼痛行為。(3)辣椒素致痛實(shí)驗(yàn)和福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)顯示:給予WA處理的小鼠,對(duì)于辣椒素引起的疼痛行為有抑制作用,不論是舔腳的次數(shù)還是時(shí)間都明顯下降;對(duì)福爾馬林所致的疼痛無(wú)明顯抑制作用。(4)CCI模型建立中,小鼠的機(jī)械縮足閾值和熱縮足反射潛伏期結(jié)果顯示,從術(shù)后第3天開(kāi)始下降,第5天達(dá)到最低值;而當(dāng)?shù)?天開(kāi)始給藥處理后,實(shí)驗(yàn)第7天開(kāi)始機(jī)械縮足閾值和熱縮足反射潛伏期均緩慢回升,于第9天達(dá)到頂峰,并在第9-13天閾值保持基本穩(wěn)定,進(jìn)入平臺(tái)期。第13天的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:naive組和sham組基本保持一致,無(wú)差異;CCI組各閾值則顯著下降(P0.001);WA-L組、WA-H組、GBPT組,機(jī)械縮足閾值(MWT)和熱縮足反射潛伏期(TWL)都顯著升高,與CCI組相比,差異明顯(P0.001)。且WA-L在灌胃2h時(shí)閾值最高,鎮(zhèn)痛效果最為明顯,6h仍與CCI組有明顯差異,說(shuō)明WA鎮(zhèn)痛藥效可達(dá)6h,甚至以上。(5)鈣成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:WA-L(6.4μg/mL)和WA-H(64μg/mL)均有效抑制了TRPV1激動(dòng)劑辣椒素(capsaicin)引起的鈣離子內(nèi)流(P0.01或P0.001)。鈣成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CCI模型建立后,DRG神經(jīng)元對(duì)TRPV1激動(dòng)劑辣椒素的反應(yīng)比例明顯增加(P0.05);而給藥處理后,WA-H組、GBPT組DRG神經(jīng)元對(duì)辣椒素反應(yīng)的比例則顯著下降(P0.05或P0.001),WA-L組雖沒(méi)有顯著性差異,但有下降的趨勢(shì)。(6)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)表明:CCI造模后明顯增加了TRPV1+神經(jīng)元的比例(P0.05);而不論是WA-L組、WA-H組,又或是GBPT組,均顯著減少了TRPV1+神經(jīng)元的比例(P0.05或P0.001)。(7)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與免疫熒光染色結(jié)果相一致,CCI組增加了TRPV1的表達(dá)(P0.05),而WA-L組、WA-H組、GBPT組顯著下調(diào)了TRPV1的表達(dá)(P0.05或P0.001或P0.01)。(8)細(xì)辛脂素有效抑制傷害性熱刺激和機(jī)械刺激引起的疼痛行為,2.5mg/kg濃度可達(dá)最佳鎮(zhèn)痛效果。(9)完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型中,小鼠的TWL在造模第2天明顯下降,而當(dāng)給藥處理后1h后,各組TWL呈上升趨勢(shì),且2h后Asarinin-M組(25mg/kg)鎮(zhèn)痛效果最好(p0.01)。Vonfrey實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:0.4g、0.07g的力度刺激下,造模第2天各組小鼠抬腳的頻率明顯上升,給藥處理后,1h后抬腳頻率逐漸下降,2h后達(dá)到最低(P0.05或P0.001或P0.01)。結(jié)論:細(xì)辛水提液及其指標(biāo)性成分細(xì)辛脂素對(duì)多種急慢性疼痛通均具有顯著的鎮(zhèn)痛療效,細(xì)辛水提液通過(guò)調(diào)節(jié)TRPV1的表達(dá)和活性抑制CCI誘導(dǎo)的疼痛行為。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

圖２－ｌ邋ＵＨＰＬＣ－ＴＱ／ＭＳ的方法鑒定主要化合物逡逑圖丨：采用ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ／ＭＳ／ＭＳ方法分析了細(xì)辛的主要成分。（Ａ－Ｃ）通過(guò)比較ｔＲ、＞ｔｍａｘ和ｗ邋ｚ與標(biāo)準(zhǔn)逡逑化合物的特點(diǎn)，采用ＬＣ－ＭＳ法從光譜中鑒定了去甲烏藥堿和ｃａｕｌｅｓｎａｒｉｎｓｉｄｃ。逡逑．

為時(shí)間較短（６．５４±０．３９ｓ），而灌胃給予ＷＡ后以時(shí)間依賴的方式顯著延遲了甩尾行為的時(shí)逡逑間。與對(duì)照組相比，ＷＡ邋（３２ｍｇ／ｋｇ）抑制有害熱刺激引起的疼痛長(zhǎng)達(dá)５ｈ，并且在給藥２ｈ后逡逑顯示出最佳的鎮(zhèn)痛效果（］４．４１±0．４４，邋ｐ＜０．００１）（圖２Ａ）。根據(jù)甩尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在處理２ｈ后逡逑比較不同濃度ＷＡ邋（５．３ｍｇ／ｋｇ，３２ｍｇ／ｋｇ，丨９２ｍｇ／ｋｇ）的鎮(zhèn)痛作用。如圖２Ｂ所示，ＷＡ以劑逡逑量依賴性方式顯示鎮(zhèn)痛作用，ＷＡ在以３２ｍｇ／ｋｇ的濃度下顯示出最佳的鎮(zhèn)痛作用。因此，逡逑我們最終選擇了邋３２ｍｇ／ｋｇ濃度的ＷＡ治療２ｈ后測(cè)量隨后的行為實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步確定細(xì)逡逑辛水提液抗傷害感受的功效，通過(guò)機(jī)械縮足反射閾值（ＭＷＴ）和熱縮足反射潛伏期（ＴＷＬ）逡逑測(cè)定評(píng)價(jià)了邋ＷＡ的鎮(zhèn)痛作用。實(shí)驗(yàn)表明，ＷＡ顯著減輕了傷害性熱刺激和機(jī)械刺激引起的逡逑反應(yīng)。ＴＷＬ邋從邋５．５３±０．５２邋增加到邋ｎ．９２±０．６８邋（ｐ＜０．0０0，邋ＭＷＴ邋也從邋１．０７士０．１３邋顯著增加到逡逑１．５１±０．１４邋（ｐ＜０．０５）（圖邋２Ｃ邋和邋Ｄ）。逡逑ａ邋２0ｉ邐ｒ邋２．０－１逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＷＡ逡逑＾邋＊逡逑＊＊＊逡逑ｓ＾１５－邐ｉｓ－邋Ｈ－逡逑邐邐邐邐邐＂＊＊邐＊邐邐１邐０．５－逡逑ｊ邐Ｔｉｍｅ（ｈ）邐ｊ逡逑０邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐ｉ邐0．0■邋■邋ｉ邋

逡逑圖２：邋ＷＡ在４８°Ｃ水浴浸尾實(shí)驗(yàn)、熱刺激和機(jī)械刺激中的抗傷害作用。（Ａ）４８°Ｃ水浴浸尾實(shí)驗(yàn)的抗傷害逡逑作用。觀察ＷＡ治療后的甩尾潛伏期，ＷＡ治療２ｈ后鎮(zhèn)痛效果最佳（ｎ＝８）。（Ｂ）ＷＡ表現(xiàn)出劑量依賴性逡逑的抗傷害作用（ｎ＝８）。（Ｃ）邋ＷＡ處理２小時(shí)后測(cè)定ＭＷＴ邋（３２ｍｇ／ｋｇ，邋ｎ＝８）。（Ｄ）治療后２ｈ測(cè)定ＴＷＬ逡逑（３２ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝８）邋（＊ｐ＜０．０５，邋＂ｐｃＯ．Ｏｌ，＊＊＊ｐ＜０．００１）。逡逑２．４討論逡逑熱痛是日常生活中典型的疼痛形式，浸尾實(shí)驗(yàn)和熱輻射實(shí)驗(yàn)是最為常見(jiàn)的急性疼痛實(shí)逡逑驗(yàn)。？１１１＾出等［１１５］采用升溫?zé)岚逶囼?yàn)和升溫水浴試驗(yàn)測(cè)量大鼠熱痛閾值。上述結(jié)果顯示，給逡逑予ＷＡ灌胃處理后，從ｌｈ開(kāi)始，小鼠熱痛閾值逐漸升高，２ｈ達(dá)到峰值，并能持續(xù)５ｈ。顯逡逑然，ＷＡ能緩解熱刺激誘導(dǎo)的疼痛行為；并且，機(jī)械刺激也進(jìn)一步說(shuō)明了邋ＷＡ能緩解傷害逡逑性機(jī)械刺激誘導(dǎo)的疼痛反應(yīng)。所以

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本文編號(hào)：2821125