胰腺癌一種死亡率極高的惡性消化系統(tǒng)腫瘤,接近60%的胰腺癌患者的死因與肝轉(zhuǎn)移癌有關(guān),目前針對胰腺癌的手術(shù)及放化療等治療方法效果均不理想,因此尋求一種可以有效治療胰腺癌并抑制其轉(zhuǎn)移的方法是目前胰腺癌相關(guān)研究的重點。大量研究已明確有多種miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其中miRNA-1271是一種具有腫瘤抑制效應,參與抑制腫瘤上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、誘導腫瘤細胞凋亡的miRNA,但是其對胰腺癌細胞的影響及調(diào)控作用的相關(guān)研究還很少。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學是胰腺癌綜合治療方法的重要組成部份,大黃素是眾多抗癌中草藥中的有效活性成分,研究表明大黃素對包括胰腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有治療作用,并具有通過調(diào)節(jié)miRNA抗腫瘤的功效,但是關(guān)于大黃素抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移侵襲的機制研究目前未見大量報道。本實驗課題從mi RNA對胰腺癌EMT的調(diào)控機制入手,研究miRNA-1271和大黃素對胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用,實驗分為三部分。實驗第一部分目的:驗證miRNA-1271對胰腺癌細胞EMT的影響作用。方法:分別將miRNA-1271模擬物,miRNA-1271抑制物,及陰性對照物轉(zhuǎn)染至胰腺癌細胞,并設立對照組。使用western-blot實驗方法檢測胰腺癌細胞EMT相關(guān)標志物E-cadherin、ZEB1、TWIST1的蛋白含量變化,RT-PCR實驗檢測各實驗組胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,Transwell小室模型檢測各實驗組的胰腺癌細胞侵襲能力的改變。結(jié)果:轉(zhuǎn)染mi RNA-1271模擬物組與其他實驗組比較,miRNA-1271和E-cadherin的mRNA表達水平升高(P0.05),各實驗組ZEB1,TWIST1的m RNA水平無明顯差異(P0.05)。miRNA-1271模擬物組同其他實驗組相比E-cadherin蛋白表達水平升高,ZEB1,TWIST1蛋白表達水平降低(P0.05)。miRNA-1271抑制物組胰腺癌細胞的E-cadherin蛋白水平最低,而ZEB1,TWIST1的蛋白表達水平較其他組明顯升高(P0.05)。Transwell小室模型實驗miRNA-1271模擬物組胰腺癌細胞侵襲能力較其他各組明顯下降(P0.05)。結(jié)論:結(jié)果表明miRNA-1271可以明顯抑制胰腺癌細胞的EMT過程。而RT-PCR檢測各實驗組ZEB1,TWIST1的mRNA水平無明顯差異,提示miRNA-1271可能作用于ZEB1,TWIST1基因的轉(zhuǎn)錄后階段并不降解靶基因的mRNA。實驗第二部分目的:使用不同濃度大黃素處理胰腺癌細胞,觀察胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271水平及EMT標志分子的變化。方法:分別使用高、低濃度大黃素處理胰腺癌細胞,并設立對照組。使用western-blot實驗檢測各胰腺癌細胞EMT標志物E-cadherin、ZEB1、TWIST1的蛋白含量變化,RT-PCR實驗檢測各實驗組胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,Transwell小室模型檢測各實驗組的胰腺癌細胞侵襲能力的改變。結(jié)果:高低劑量大黃素組與對照組相比,胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271和E-cadherin的mRNA表達水平升高(P0.05),各實驗組ZEB1,TWIST1的mRNA水平無明顯差異(P0.05)。大黃素組同對照組相比E-cadherin蛋白表達水平升高(P0.05),ZEB1,TWIST1蛋白表達水平降低(P0.05)。Transwell小室模型實驗證明大黃素組胰腺癌細胞侵襲能力較對照組明顯下降(P0.05),而高濃度大黃素組較低濃度大黃素組對胰腺癌細胞的EMT抑制作用更加顯著(P0.05)。結(jié)論:實驗結(jié)果證明大黃素通過提高胰腺癌細胞內(nèi)miRNA-1271的水平進而實現(xiàn)對胰腺癌細胞EMT的抑制作用。實驗第三部分目的:建立裸鼠脾臟注射胰腺癌細胞致肝轉(zhuǎn)移的動物模型,驗證大黃素在動物體內(nèi)實驗中對胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法:使用45只裸鼠進行脾臟注射胰腺癌細胞建立胰腺癌肝轉(zhuǎn)移動物模型,實驗分為3組,高劑量大黃素組(大黃素灌胃,50mg/Kg體重/天),低劑量大黃素組(大黃素灌胃,20mg/Kg體重/天),對照組(2ml生理鹽水灌胃),每組各15只。6周后處死裸鼠,觀察裸鼠胰腺癌肝轉(zhuǎn)移情況,計算各組裸鼠肝轉(zhuǎn)移癌的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量,轉(zhuǎn)移灶增殖抑制率,肝轉(zhuǎn)移抑制率。使用RT-PCR實驗檢測各實驗組胰腺癌肝轉(zhuǎn)移癌組織內(nèi)miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,使用Western-blot及免疫組化實驗檢測胰腺癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤組織中E-cadherin、ZEB1和Twist1蛋白表達水平。結(jié)果:高、低劑量大黃素組裸鼠的肝轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量,轉(zhuǎn)移灶增殖抑制率,肝轉(zhuǎn)移抑制率等指標均要優(yōu)于對照組(P0.05),低劑量大黃素組裸鼠肝轉(zhuǎn)移的治療效果要稍差于高劑量大黃素組。該結(jié)果提示大黃素對于胰腺癌肝臟轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用,且抑制效果隨著大黃素劑量的增加而提高。高低劑量大黃素組與對照組相比,胰腺癌組織內(nèi)miRNA-1271和E-cadherin的mRNA含量水平顯著升高(P0.05)。Western-blot實驗及免疫組化實驗結(jié)果顯示大黃素組同對照組相比,胰腺癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤組織中E-cadherin蛋白含量明顯升高,ZEB1和Twist1蛋白表達水平明顯下降(P0.05)。結(jié)論:裸鼠動物體內(nèi)實驗驗證了大黃素通過提高胰腺癌內(nèi)miRNA-1271的含量抑制胰腺癌細胞的EMT過程,進而發(fā)揮對胰腺癌肝轉(zhuǎn)移的治療及預防作用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1 MTT 實驗檢測大黃素對胰腺癌細胞增殖能力的抑制情況已有較多研究發(fā)現(xiàn)大黃素可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi) miRNA（microRNA）的水平從而發(fā)揮生物學作用,如抑制腫瘤細胞生長等。目前關(guān)于大黃素對胰腺癌治療的具體機制報道較少，而且其機制與腫瘤相關(guān) miRNA 表達水平的調(diào)節(jié)是否相關(guān)不得而知。近年來人們對 miRNA 進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞包括生長、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學行為均有 miRNA 參與，并發(fā)揮調(diào)控作用，包括多種癌基因和抑癌基因[7]。miRNA 是一種由 19-25 個核苷酸組成的非編碼單鏈小 RNA，參與調(diào)控大約 30%的蛋白編碼 mRNA[8]。miRNA 對基因的調(diào)控方式并非單一一種，有多種形式較為復雜，其中最主要的機制為 miRNA 與靶 mRNA 的 3’非編碼區(qū)（3’-UTR）結(jié)合,抑制靶 mRNA 的翻譯或者降解靶 mRNA，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[9]。miRNA 對基因調(diào)控的重要性已經(jīng)成為共識，尤其是 miRNA 在腫瘤和正常組織中的差異性表達和機制越來越受到科學家們的關(guān)注，相比正常組織，腫瘤組

上皮標志物含量，從而促進 Snail-1 誘導的乳腺癌細胞 EM發(fā)現(xiàn) miRNA-10 是細胞 EMT 過程中 TWIST1 調(diào)控通路的研究發(fā)現(xiàn) miRNA-1271 對多種腫瘤細胞具有抑制作用。m腫瘤中表達下調(diào),并參與抑制肺癌，胃癌等多種腫瘤的侵藥[17]。結(jié)合上述 miRNA 與腫瘤治療的相關(guān)研究，本課題立腺癌的 miRNA 之間的關(guān)系問題進行了相關(guān)預實驗。使用素對 SW1990 胰腺癌細胞進行處理，RT-PCR 檢測胰腺癌的含量水平是否發(fā)生改變。預實驗檢測了 miRNA-200、mimiRNA-9、miRNA-214、miRNA-1271 一共 6 種參與 EM發(fā)現(xiàn)大黃素可以明顯升高胰腺癌細胞內(nèi) miRNA-1271 的以推測大黃素可能與 miRNA-1271 存在關(guān)聯(lián)性，并可能而對胰腺癌產(chǎn)生治療作用，但該假設需要進一步實驗證實

預測網(wǎng)站進行檢索發(fā)現(xiàn) miRNA-1271 與 ZEB1、Twist1 這兩個 EMT 標志物具有關(guān)聯(lián)性，后兩者可能是 miRNA-1271 的靶基因（圖 3）。選擇人胰腺癌和正常癌旁組織進行基因組 miRNA Microarray 分析，結(jié)果顯示，miRNA-1271 在人胰腺癌組織中比正常癌旁組織表達顯著降低（圖 4）。為了驗證篩選的結(jié)果，采用RT-PCR 實驗檢測了 58 例胰腺癌組織和正常癌旁組織的 miRNA-1271 的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常癌旁組織相比，所有胰腺癌組織 miRNA-1271 含量水平都下調(diào)，結(jié)果如圖 4 所示。然后選取了人胰腺癌細胞系 SW1990、BXPC3、PANC-1和 ASPC-1 以及正常人胰腺導管上皮細胞系 HPDE6c7，采用 RT-PCR 實驗檢測各細胞系中 miRNA-1271 含量水平。結(jié)果顯示，與 HPDE6c7 人正常胰腺細胞相比，人胰腺癌細胞系中的 miRNA-1271 含量水平顯著下調(diào)（圖 4）。然后我們應用Western blot 實驗檢測了人胰腺癌細胞系和正常胰腺導管上皮細胞系中 EMT 相關(guān)標志物 ZEB1 和 Twist1 蛋白的表達水平，結(jié)果顯示與正常人胰腺導管上皮細胞相比，ZEB1 和 Twist1 在人胰腺癌細胞系中表達均有不同程度的增加（圖 4）。故結(jié)合此前期預實驗研究結(jié)果，我們推測miRNA-1271可能具有抑制胰腺癌EMT的作用。

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本文編號：2821174