背景:結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一,全球每年新發(fā)病例及死亡病例數(shù)居惡性腫瘤第3位與第4位。50%以上結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者最終會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,是結(jié)直腸癌術(shù)后患者死亡的主要原因。扶正解毒方是首都國醫(yī)名醫(yī)、全國名中醫(yī)樸炳奎教授臨床治療結(jié)直腸癌的經(jīng)驗(yàn)方,臨床能有效防止結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的常見誘因,而miR21/PDCD4/AP-1信號(hào)通路的表達(dá)改變可能是結(jié)直腸癌發(fā)生EMT以及侵襲、轉(zhuǎn)移的主要原因。我們推測(cè),扶正解毒方是通過作用于miR21/PDCD4/AP-1信號(hào)通路,逆轉(zhuǎn)EMT形成,來抑制結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的。目的:明確扶正解毒方逆轉(zhuǎn)EMT防止大腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與EMT關(guān)鍵靶點(diǎn)方法:1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,設(shè)立扶正解毒方組與對(duì)照組,皮下接種Lovo細(xì)胞后,用藥干預(yù)28天,觀察扶正解毒方對(duì)皮下移植瘤重量及EMT相關(guān)蛋白;2、體外實(shí)驗(yàn)使用SD大鼠制備扶正解毒方低、中、高劑量組含藥血清及空白血清。使用不同劑量組的扶正解毒方含藥血清及空白血清培養(yǎng)Lovo細(xì)胞,CCK8法檢測(cè)扶正解毒方含藥血清對(duì)Lovo細(xì)胞的抑制率,觀察扶正解毒方含藥血清在二維培養(yǎng)條件下對(duì)Lovo細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響及侵襲遷移能力的影響,并提取扶正解毒方含藥血清及空白血清培養(yǎng)條件下Lovo細(xì)胞的總蛋白,通過Western Blotting檢測(cè)扶正解毒方含藥血清對(duì)Lovo細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白及可能作用靶點(diǎn)蛋白表達(dá)量的影響;通過慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)miR-21及空白對(duì)照Lovo細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株,驗(yàn)證扶正解毒方含藥血清對(duì)EMT相關(guān)基因及可能作用靶點(diǎn)mRNA的影響。結(jié)果:1、扶正解毒方在體外能抑制人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖,體外高劑量含藥血清組72h抑制率35%;2、空白血清培養(yǎng)72h后,Lovo細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,并出現(xiàn)卷曲、拉絲,呈上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞兩種形態(tài),以間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)為主;扶正解毒方低劑量組含藥血清培養(yǎng)72h后Lovo細(xì)胞之間拉絲減少,仍呈上皮細(xì)胞、間質(zhì)兩種形態(tài),中劑量組含藥血清培養(yǎng)72h后Lovo細(xì)胞基本在平面生長(zhǎng),仍有少數(shù)細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)絲狀,高劑量組含藥血清培養(yǎng)72h后,Lovo細(xì)胞呈多角形及梭形,單層緊密排列,大部分Lovo細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)上皮細(xì)胞樣;3、扶正解毒方含藥血清低、中、高劑量組均能不同程度的抑制Lovo細(xì)胞遷移,其中高劑量組效果最佳;4、Transwell小室過膜Lovo細(xì)胞數(shù):扶正解毒方高劑量組扶正解毒方中劑量組扶正解毒方低劑量組空白血清組。5、扶正解毒方含藥血清能促進(jìn)Lovo細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下E-cadherin、PDCD4、mRNA的表達(dá),較空白血清組有顯著差異,且能抑制Lovo細(xì)胞N-cadherin、MMP2、Vim、β-canteninmRNA 表達(dá)。同時(shí),與 miR-21/Lovo 細(xì)胞+空白血清組相比,扶正解毒方含藥血清能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-21導(dǎo)致的E-cadherin、PDCD4 mRNA 表達(dá)下調(diào),及 N-cadherin、MMP2、Vim、β-canteninmRNA 表達(dá)上調(diào),P0.05,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;6、扶正解毒方含藥血清可促進(jìn)Lovo細(xì)胞總蛋白中E-cadherin表達(dá),隨著含藥血清劑量的升高,促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)。扶正解毒方含藥血清能抑制Lovo細(xì)胞總蛋白中N-cadherin表達(dá),抑制效果隨濃度增加而增強(qiáng)。扶正解毒方含藥血清可促進(jìn)Lovo細(xì)胞總蛋白中PDCD4表達(dá),抑制β-cantenin、c-Jun表達(dá);7、扶正解毒方對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤的抑制結(jié)果顯示扶正解毒方對(duì)裸鼠成瘤有一定抑制作用;8、與空白對(duì)照組相比,中藥組皮下移植瘤組織切片中E-cadherin、PDCD4表達(dá)增加、Vimentin、β-cantenin 表達(dá)減少;9、扶正解毒方可顯著上調(diào)結(jié)腸癌裸鼠移植瘤中PDCD4、E-cadherin蛋白的表達(dá),降低腫瘤組織內(nèi)c-Jun、Vimentin、N-cadherin蛋白的表達(dá)(P0.05),也可降低β-cantenin蛋白的表達(dá),但不具有顯著性。結(jié)論:1、扶正解毒方在體內(nèi)外均能抑制人高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖;2、扶正解毒方含藥血清能有效抑制Lovo細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力,可能與影響EMT進(jìn)程相關(guān);3、扶正解毒方含藥血清可上調(diào)E-cadherin、PDCD4蛋白表達(dá),下調(diào)N-cadherin、β-cantenin、c-Jun的蛋白表達(dá),呈劑量依賴,高劑量組含藥血清效果最顯著;4、扶正解毒方含藥血清可抑制Lovo細(xì)胞N-cadherin、Vimentin、MMP2、β-cantenin mRNA 的表達(dá),促進(jìn) E-cadherin、PDCD4 mRNA 的表達(dá);5、扶正解毒方可促進(jìn)人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤中E-cadherin、PDCD4蛋白的表達(dá),抑制N-cadherin、Vimentin、β-cantenin及c-Jun蛋白的表達(dá),可能影響結(jié)腸癌裸鼠移植瘤EMT。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

３？結(jié)果逡逑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白血清組相比，扶正解毒方各組含藥血清在加藥后２４ｈ、４８ｈ、逡逑７２ｈ均可不同程度地抑制Ｌｏｖｏ細(xì)胞增殖（見圖２．１），而且該作用呈現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量逡逑依賴性。扶正解毒方高劑量組７２ｈ的抑制率最高，達(dá)到３５％邋（見表２．１）。逡逑表２．１扶正觶毒方含藥血清在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Ｌｏｖｏ細(xì)胞增殖的抑制率逡逑ｍ＼邐４８ｈ邐７２ｈ逡逑空白組邐０邐０邐６逡逑４５逡逑

圖２．邋２邋ＣＣＫ－８反應(yīng)原理圖逡逑弓１邋自邋ｈｔｔｐ：邋／／ｗｗｗ．邋ｄｏｊｉｎｄｏ．邋ｃｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｃ／Ｃｅｌｌ－Ｃｏｕｎｔｉｎｇ－Ｋｉｔ－８．邋ｈｔｍ逡逑

其中高劑量組效果最佳；扶正解毒方含藥血清低、中、高劑量組均能不同程度地逡逑抑制Ｌｏｖｏ細(xì)胞遷移能力（見表４．１），其中高劑量組抑制效果最佳，遷移率僅１．邋２５％±０．邋９４％逡逑（見圖４．１）。逡逑５３逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2819269