目的:本課題為國家自然科學基金資助項目(81603119)、北京市自然科學基金資助項目(7174316)的主要研究內容。鹽酸小檗堿又名黃連素,其化學分子式為[C20H18NO4]+Cl-,屬于異喹啉類生物堿,具有強的抗菌能力和廣泛的抗菌譜。然而臨床上抗生素的廣泛使用一直在加速耐藥菌的產生,特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicilin-resistant Staphylococcus,MRSA)。MRSA多重耐藥的特點為臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。之前有研究報道細菌的胞外基質中酚溶調制肽(phenol-soluble modulins,PSMs)是導致葡萄球菌致病性的主要毒力因子。該毒力因子的作用機制為PSMs多肽聚集形成細菌淀粉樣纖維,PSMs進一步調控細菌生物膜的形成及釋放,加重機體炎癥損傷,進而保護細菌免受機體免疫系統(tǒng)的攻擊,并賦予細菌強大的致病力。本實驗從MRSA的耐藥機制著手,研究對象為鹽酸小檗堿與MRSA的生物膜、PSMs多肽以及PSMs單體的相互作用,進而探討鹽酸小檗堿通過干擾或阻斷PSMs多肽聚合形成淀粉樣纖維、抑制其發(fā)展形成生物膜發(fā)揮的生物學功能、降低炎癥損傷的可行性,為臨床治療MRSA感染提供有效的思路和手段。材料與方法1.材料:實驗用鹽酸小檗堿購自Sigma公司,使用時用超純水配制,超凈臺內無菌操作,分裝凍存。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA-ATCC33591)為本實驗室凍存于-80℃冰箱中的菌株,用時取出。2.方法:(1)本研究繪制了MRSA-ATCC33591的生長曲線,采用抑菌環(huán)實驗驗證不同濃度鹽酸小檗堿對MRSA-ATCC33591在營養(yǎng)肉湯中生長情況的影響。對比陽性對照觀察其抑菌性。(2)采用激光共聚焦顯微鏡觀察MRSA生物膜在不同濃度鹽酸小檗堿條件下的完整性,分析鹽酸小檗堿對生物膜完整性的影響,探討鹽酸小檗堿對MRSA生物膜形成的作用。(3)采用剛果紅染色觀察鹽酸小檗堿對MRSA生物膜中淀粉樣纖維形成的影響,采用透射電鏡觀察不同濃度鹽酸小檗堿條件下MRSA生物膜中胞外淀粉樣纖維的形態(tài),研究鹽酸小檗堿對MRSA生物膜中淀粉樣纖維形成的影響。(4)采用Gromos 96(53A6)力場以及Gromacs 4.5軟件,利用分子動力學模擬技術研究鹽酸小檗堿和PSM單體之間的相互作用。(5)建立DSS誘導的小鼠急性結腸炎炎癥模型,觀測鹽酸小檗堿對化學致炎劑導致的炎癥損傷中的作用。(6)建立MRSA感染的小鼠皮膚膿腫炎癥模型,觀測鹽酸小檗堿對MRSA或PSMs導致炎癥損傷的作用,從而明確鹽酸小檗堿在MRSA致病中的抗炎作用。結果:1.通過抑菌環(huán)實驗及分光光度計法,驗證了鹽酸小檗堿在低濃度時不能直接殺死細菌,超過閾值時具有濃度依賴性的抑制細菌生長的特性。2.激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示鹽酸小檗堿能夠破壞MRSA生物膜的連續(xù)性。3.剛果紅染色實驗提示鹽酸小檗堿能夠抑制細菌胞外淀粉樣肽的形成,進而干擾生物膜的形成及穩(wěn)定性。4.透射電鏡觀察揭示了鹽酸小檗堿對MRSA淀粉樣纖維形成的抑制作用,阻礙PSM單體釋放及PSMs多肽聚集形成淀粉樣纖維,影響生物膜形成。5.分子動力學模擬表明鹽酸小檗堿與MRSA分泌的淀粉樣纖維單體PSM-α2的結合是通過疏水性作用結合在PSM-α2苯環(huán)上的。6.小鼠的潰瘍性結腸炎模型試驗表明鹽酸小檗堿對化學致炎劑誘導的炎癥性腸病的形成具有一定的干預作用。7.小鼠的皮膚膿腫模型實驗表明鹽酸小檗堿對體內耐藥菌引起的感染具有較好的治療效果,并對其可能的作用機制進行了闡述。結論:1.本課題采用抑菌環(huán)實驗和激光共聚焦顯微鏡觀察結果分析得出鹽酸小檗堿對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的抑制作用不是通過直接殺滅細菌而是通過破壞生物膜的完整性來抑制細菌生長。2.剛果紅染色實驗和透射電鏡結果表明鹽酸小檗堿能夠通過抑制耐藥菌生物膜中淀粉樣纖維形成來破壞穩(wěn)定性生物膜的形成。3.鹽酸小檗堿和PSM單體之間動力學模擬表明鹽酸小檗堿與PSM單體的結合是通過疏水性相互作用實現的。4.動物模型顯示鹽酸小檗堿對MRSA-ATCC33591引起的皮膚膿腫模型具有一定的干預效果,說明鹽酸小檗堿具有體內的抑菌抗炎作用。5.鹽酸小檗堿可以與MRSA分泌的PSMs多肽進行相互作用,進而影響PSMs多肽聚合形成生物膜,明確鹽酸小檗堿在抑制MRSA感染中的作用機制。
【學位單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

Ber的分子結構

Ber的主要原植物A.黃連B.黃檗C.三顆針（細葉小檗）

圖 1-1. MRSA-ATCC33591 的標準生長曲線。按上述實驗方法，以 OD 值為 x 值，相應 OD600 的活菌數為 y 值，活菌量的關系曲線：y=109·x+5×107. R2=0.9953.

【參考文獻】

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本文編號：2818429