背景中西醫(yī)對于“腎主骨”的認(rèn)識(shí)既有區(qū)別也有聯(lián)系。西醫(yī)發(fā)現(xiàn)腎臟功能部分或全部喪失時(shí),機(jī)體的骨代謝會(huì)發(fā)生紊亂,出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、骨硬化等癥狀。中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為“腎主骨”,“腎精”可以滋養(yǎng)骨骼。促紅細(xì)胞生成素EPO(erythropoietin,EPO),具有促進(jìn)造血、腦保護(hù)等多種作用,為本課題組提出的“腎精”的生物物質(zhì)基礎(chǔ)的假設(shè)物質(zhì)之一。腎虛骨質(zhì)疏松小鼠的EPO含量如何變化,外源性EPO和傳統(tǒng)補(bǔ)腎益精方藥右歸飲對腎虛骨質(zhì)疏松模型有無改善作用及其與EPO的相關(guān)性,目前尚未見報(bào)道。研究這一問題對于揭示補(bǔ)腎益精方藥的生物學(xué)作用機(jī)制具有重要意義。本研究得到了國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473549)和教育部中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(XDJK2017D158)的支持。目的觀察腎虛骨質(zhì)疏松與EPO的相關(guān)性,及右歸飲的改善作用;驗(yàn)證“EPO為‘腎精’的物質(zhì)基礎(chǔ)之一”的假設(shè),尋找“腎精”的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。方法1.腎虛骨質(zhì)疏松小鼠模型的構(gòu)建及模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)(1)腎虛骨質(zhì)疏松小鼠模型:C57BL/6J小鼠,雄性,體重24±2 g,飼喂0.2%腺嘌呤模型飼料5周,自由攝食飲水,每周測量體重和體溫,造模結(jié)束后測定其它指標(biāo)。(2)模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn):每只小鼠的體重、體溫、睪酮(testosterone,T)、皮質(zhì)醇(cortisol,CORT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨密度和骨小梁數(shù)量顯著低于正常組小鼠均值(均P0.05);肌酐(creatinine,CREA)、尿素氮(BUN)、鈣(calcium,Ca)和磷(phosphorus,P)顯著高于正常組小鼠均值(均P0.05)。(3)模型成功率:試驗(yàn)顯示上述造模方法模型成功率達(dá)80%—90%,穩(wěn)定可行。2.試驗(yàn)動(dòng)物分組、組間均衡性檢驗(yàn)及給藥(1)外源性EPO對腎虛骨質(zhì)疏松小鼠的試驗(yàn):在上述方法造模2周時(shí),根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將造模小鼠分為模型組、EPO5000 U·kg~(-1)組,每組15只。經(jīng)統(tǒng)計(jì)各造模組小鼠體溫、體重、腎功能、內(nèi)分泌、骨代謝和骨顯微參數(shù),結(jié)果顯示無顯著性差異(均P0.05)后,方進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。繼續(xù)飼喂0.2%的腺嘌呤飼料,EPO組皮下注射5000 U·kg~(-1)的EPO,正常組和模型組皮下注射等體積的生理鹽水,每周3次,3周后結(jié)束。(2)右歸飲對腎虛骨質(zhì)疏松小鼠的試驗(yàn):在上述方法造模2周時(shí),根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將造模小鼠分為模型組、右歸飲10、20和40 g·kg~(-1)組,每組20只。經(jīng)統(tǒng)計(jì)各造模組小鼠體溫、體重、腎功能、內(nèi)分泌、骨代謝和骨顯微參數(shù),結(jié)果顯示無顯著性差異(均P0.05)后,方進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。繼續(xù)飼喂0.2%的腺嘌呤飼料,右歸飲組灌胃相應(yīng)劑量右歸飲,正常組和模型組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水,每天1次,3周后結(jié)束給藥。3.腎虛骨質(zhì)疏松小鼠的改善指標(biāo)及其測定方法(1)外觀形態(tài):觀察每組小鼠的蜷縮弓背狀態(tài)和毛發(fā)的顏色,每周測量各組小鼠體重和體溫。(2)腎的形態(tài)學(xué):觀察各組小鼠腎臟大體形態(tài)學(xué),腎臟行石蠟切片制作HE染色觀察其組織形態(tài)學(xué)。(3)腎功能指標(biāo):心臟取血,離心取血清,用全自動(dòng)血液生化儀測定CREA和UREA含量。(4)內(nèi)分泌指標(biāo):用酶聯(lián)免疫法測定血清中CORT和T的含量。(5)骨形態(tài)學(xué)指標(biāo):股骨脫鈣后,行石蠟切片制作HE染色觀察其組織形態(tài)學(xué)。(6)骨功能學(xué)指標(biāo):小動(dòng)物顯微CT測定股骨的骨密度和顯微參數(shù)指標(biāo)。(7)骨代謝指標(biāo):用全自動(dòng)血液生化儀測血清中Ca、P和ALP的含量。4.血清及骨EPO含量和信號(hào)通路蛋白測定方法(1)血清中EPO含量的測定:用酶聯(lián)免疫法檢測血清中EPO的含量;(2)股骨中HIF-EPO信號(hào)通路蛋白測定:股骨組織勻漿后,用蛋白免疫印跡法測定HIF-1α、HIF-2α、EPO和EPOR的表達(dá)。分析比較各指標(biāo)間差異性。5.試驗(yàn)用右歸飲的質(zhì)量控制方法及結(jié)果(1)右歸飲指紋圖譜的建立(1)采用高效液相色譜建立右歸飲指紋圖譜。測定條件:采用Pursuit XRs 5 C_(18)色譜柱(4.6mm×250 mm,5μm)進(jìn)行分離,流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脫,1%A→10%A(0~30 min)、10%A→17%A(30~80 min)、17%A→30%A(80~105min)、30%A→55%A(105~125 min);流速1.0 mL·min~(-1);檢測波長230 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。(2)本試驗(yàn)對所用右歸飲建立HPLC指紋圖譜,其中10批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.904。(2)右歸飲中主要成分含量測定(1)采用高效液相色譜測定右歸飲中主要成分京尼平苷酸、莫諾苷、綠原酸、梔子苷、馬錢苷、松脂醇二葡萄糖苷、甘草苷、蘆丁和甘草酸的含量。測定條件:采用Pursuit XRs 5 C_(18)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)進(jìn)行分離,流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B);梯度洗脫,1%A→10%A(0~30 min)、10%A→17%A(30~80min)、17%A→30%A(80~105 min)、30%A→55%A(105~125 min);流速1.0mL·min~(-1);檢測波長230 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。(2)本試驗(yàn)建立的HPLC色譜條件專屬性、線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率良好。測得右歸飲中9種主要成分的含量均滿足2015版藥典的要求。結(jié)果1.腎虛骨質(zhì)疏松小鼠血清及骨中EPO的含量降低造模5周后,與正常組相比,模型組小鼠血清中EPO和股骨中的HIF-1α、HIF-2α、EPO含量顯著降低,EPOR含量顯著升高(均P0.05)。2.外源性EPO能顯著改善腎虛骨質(zhì)疏松小鼠體質(zhì)給藥3周后,與模型相相比,EPO組小鼠具有以下改善:(1)外觀形態(tài):EPO組小鼠毛發(fā)的光澤、蜷縮拱背得到了改善;體重和體溫顯著性升高(均P0.05)。(2)腎形態(tài)學(xué)指標(biāo):EPO組小鼠的“大白腎”癥狀得到改善。EPO組腎單位的數(shù)量明顯增加,腎小體和腎小管的形態(tài)明顯改善,紫藍(lán)色腺嘌呤結(jié)晶明顯減少。(3)腎功能指標(biāo):EPO組小鼠血清中CREA和UREA含量顯著降低(均P0.05)。(4)內(nèi)分泌指標(biāo):EPO組小鼠血清中T和CORT含量顯著升高(均P0.05)。(5)骨形態(tài)學(xué)指標(biāo):EPO組明顯增加骨小梁的數(shù)量,骨小梁的連接中斷點(diǎn)也明顯減少。(6)骨功能學(xué)指標(biāo):EPO組的骨密度和骨小梁數(shù)量顯著增加(均P0.05),骨質(zhì)疏松的癥狀得到明顯減輕。(7)骨代謝指標(biāo):EPO組小鼠的血清中的Ca的含量顯著減少(均P0.05)。3.外源性EPO能顯著升高股骨中HIF-1α、HIF-2α、EPO含量,降低EPOR含量給藥3周后,與模型組相比,EPO組小鼠股骨中的HIF-1α、HIF-2α、EPO含量顯著升高,EPOR含量顯著降低(均P0.05)。4.右歸飲能顯著改善腎虛骨質(zhì)疏松小鼠體質(zhì)給藥3周后,(1)外觀形態(tài):與模型相相比,右歸飲20和40 g·kg~(-1)組小鼠的毛發(fā)光澤,蜷縮拱背得到了明顯改善;體重和體溫顯著性升高(均P0.05)。(2)腎的形態(tài)學(xué):右歸飲10 g·kg~(-1)組、20 g·kg~(-1)組、40 g·kg~(-1)組小鼠的“大白腎”癥狀得到改善。右歸飲20 g·kg~(-1)組、40 g·kg~(-1)組腎單位的數(shù)量明顯增加,腎小體和腎小管的形態(tài)明顯改善,紫藍(lán)色腺嘌呤結(jié)晶明顯減少。(3)腎功能指標(biāo):右歸飲20 g·kg~(-1)組、40 g·kg~(-1)組小鼠血清中CREA和UREA含量顯著降低(均P0.05)。(4)內(nèi)分泌指標(biāo):右歸飲20 g·kg~(-1)組、40 g·kg~(-1)組小鼠血清中T含量顯著降低(均P0.05)。(5)骨形態(tài)學(xué)指標(biāo):右歸飲20 g·kg~(-1)組、40 g·kg~(-1)組明顯增加骨小梁的數(shù)量,骨小梁的連接中斷點(diǎn)也明顯減少。(6)骨功能學(xué)指標(biāo):右歸飲20 g·kg~(-1)組、40 g·kg~(-1)組的骨密度和骨小梁數(shù)量顯著增加(均P0.05),骨質(zhì)疏松的癥狀得到明顯減輕。(7)骨代謝指標(biāo):右歸飲20 g·kg~(-1)組、40 g·kg~(-1)組小鼠的血清中的Ca、Mg和P的含量顯著減少(均P0.05)。5.右歸飲能顯著升高腎虛骨質(zhì)疏松小鼠血液及骨中EPO含量并調(diào)節(jié)EPO信號(hào)通路給藥3周后,(1)血清中EPO含量:與模型組相比,右歸飲10 g·kg~(-1)組、20 g·kg~(-1)組小鼠血清中EPO含量顯著升高;(2)股骨中HIF-EPO信號(hào)通路觀察:右歸飲10 g·kg~(-1)組、20 g·kg~(-1)組小鼠股骨中的HIF-1α、HIF-2α、EPO含量顯著升高,EPOR含量顯著降低(均P0.05)。結(jié)論1.采用雄性C57/B6L小鼠,以0.2%腺嘌呤飼料飼喂5周后,能成功構(gòu)建腎虛骨質(zhì)疏松模型。該模型不僅具有常規(guī)腎虛指標(biāo)和骨質(zhì)疏松指標(biāo),且模型小鼠血清中EPO和股骨中EPO,及其信號(hào)通路相關(guān)蛋白HIF-1α、HIF-2α的含量均顯著下降,EPOR的含量均顯著升高。2.外源性EPO可顯著改善腎虛骨質(zhì)疏松小鼠的體質(zhì)。其機(jī)制可能與升高血清中EPO和股骨中EPO、HIF-1α、HIF-2α的含量,降低EPOR含量的表達(dá),調(diào)節(jié)HIF-EPO信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。3.右歸飲可顯著改善腎虛骨質(zhì)疏松小鼠的體質(zhì)。其機(jī)制可能與升高血清中EPO和股骨中EPO、HIF-1α、HIF-2α的含量,降低EPOR含量的表達(dá),調(diào)節(jié)HIF-EPO信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。試驗(yàn)用右歸飲質(zhì)量控制指紋圖譜及9種成分的含量測定為試驗(yàn)結(jié)果的可信性、可重復(fù)性提供了基本保障。4.腎虛骨質(zhì)疏松與可能EPO含量下降有顯著相關(guān)性,外源性EPO能顯著改善腎虛及其骨質(zhì)疏松。雙補(bǔ)腎陰腎陽并且養(yǎng)血生精的右歸飲顯著改善腎虛骨質(zhì)疏松的同時(shí)能顯著升高EPO含量。上述結(jié)果支持“EPO可能為‘腎精’的生物學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)之一”的假說。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1-1 EPO-JAK2 信號(hào)通路Figure 1-1 The signaling pathway of EPO-JAK2故本章采用腺嘌呤飼料飼喂 C57BL/6J 小鼠構(gòu)建腎虛骨質(zhì)疏松小鼠模型，并用免疫法觀察模型小鼠血清中EPO的含量和western blot法觀察股骨中HIF-EPO通路相關(guān)蛋白的變化。

照說明書測定血清中 T 和 CORT 的含量度及顯微參數(shù)的測定-20℃冰箱的右側(cè)股骨，用小動(dòng)物顯微 CT 測定股骨的理采用 IBM SPSS Statistics 20 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以 ±散程度。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以 P＜0模型的檢驗(yàn)，與正常組相比，模型組小鼠反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、去光澤，見圖 1-2。

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文表 1-1 造模 2 周模型小鼠的體重和體溫Table 1-1 The weight and temperature of mice in 2 weeks after modeling組別 第 0 周 第 1 周 第 2 周體重（g） 體溫（℃） 體重（g） 體溫（℃） 體重（g） 體溫（℃）正常組 20.03±1.53 37.12±0.41 20.63±2.11 37.04±0.53 22.10±1.81 36.78±0.89模型組 20.70±1.32 37.27±0.34 18.26±1.28 37.27±0.34 15.16±1.18##33.17±1.01##注：與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。n=10， ±SD。Note:Versus control group,#P＜0.05，##P＜0.01。n=10， ±SD。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2818207