目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種與年齡相關的持久性腦神經退行性疾病,導致記憶衰退、認知功能障礙和心理紊亂,嚴重威脅到老年人群的生命和健康,是老年疾病中最具有危害性的頑強性疾病之一。據統(tǒng)計,目前在世界范圍內有3560萬癡呆癥患者,照這樣的速度增長,估計這個數字將在2030年到2050年之間翻一番。本論文旨在基于第一維色譜技術篩選人參中乙酰膽堿脂酶(Acetylcholinesterase,AChE)抑制活性組分,應用第二維色譜質譜聯用(LC-MS)技術篩選人參中AChE抑制活性成分;基于快速高分辨液相色譜-質譜(RRLC-MS~2)與多元統(tǒng)計分析篩選人參中對人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)細胞保護的活性成分,結合分子對接和細胞代謝組學技術初步明確人參中抗AD的藥效物質基礎和作用機制,為開發(fā)治療AD的組分中藥新藥提供科學依據。方法:首先,采用Ellman改良法,以AChE抑制率為活性指標,對人參蘆頭、主根、須根、全參、木質部、韌皮部6個不同藥用部位進行篩選,篩選人參的乙酰膽堿酯酶抑制活性藥用部位;建立6個人參不同藥用部位的第一維高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜,應用主成分分析法(Principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析法(Orthogonal partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)對不同藥用部位進行判別;應用灰色關聯分析法(Grey correlation analysis,GRA)、偏最小二乘分析法(Partial least-squares,PLS)結合人參不同藥用部位HPLC指紋圖譜中10個共有組分進行AChE抑制活性組分的篩選;進而應用第二維的親和超濾-色譜-質譜聯用(Ultrafiltration liquid chromatography/mass spectrometry,UF-LC-MS)技術快速篩選出人參AChE抑制活性組分中活性較強的單體;基于分子對接技術研究人參中AChEIs與AChE受體作用機制。最后,應用針對6個人參不同藥用部位的快速高分離度液相色譜(Rapid resolution liquid chromatography,RRLC)指紋圖譜中19個共有峰,結合GRA、PLS法進行SH-SY5Y細胞保護活性成分的篩選;Annexin V/PI雙染法檢測活性成分人參皂苷Rb_1對谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞的凋亡率;基于核磁共振氫譜(H-nuclear magnetic resonance,~1H NMR)細胞代謝組學技術考察活性成分人參皂苷Rb_1對谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞代謝輪廓的變化,揭示活性成分人參皂苷Rb_1的神經細胞保護作用機制。結果:人參不同藥用部位均有一定的抗AChE能力,且不同藥用部位中須根抑制AChE能力明顯強于韌皮部、全參、主根、木質部和蘆頭,其中須根平均半抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))達到15.63μg/mL;對不同藥用部位高效液相色譜指紋圖譜的PCA分析可以看出人參蘆頭、須根、全參得到良好區(qū)分,主根、木質部、韌皮部差異不明顯,進而將主根、木質部和韌皮部單獨進行PCA和OPLS-DA分析,主根、木質部和韌皮部能得到區(qū)分,并且前兩者的區(qū)別更大;篩選得到灰色關聯系數大于0.9且PLS正相關系數最大組分為組分5(Fraction 5,Fr.5)為人參AChE抑制活性組分,進而應用親和超濾-液質聯用(UF-LC-MS)技術快速篩選出Fr.5中5個親和度大于15%的可能活性單體,經液質分析可知為皂苷Ri、Rd、Rb_3、Rb_1和Rc,活性驗證結果表明它們的IC_(50)在4.27-20.00μg/mL;分子對接結果表明結合能的大小順序與單體活性大小順序基本一致。在對SH-SY5Y細胞保護活性成分的篩選中,基于GRA分析得到的關聯系數大于0.8,OPLS-DA分析得到的VIP值大于0.5以及PLS分析系數正相關的綜合多元統(tǒng)計分析結果,共篩選出4個潛在的SH-SY5Y細胞保護活性成分;經液質分析可知為人參皂苷Rb_1、Rb_3、Rb_2和Rc,活性驗證結果表明人參皂苷Rb_1的活性最強;人參皂苷Rb_1系通過減少谷氨酸誘導的SH-SY5Y細胞凋亡發(fā)揮了對神經細胞氧化損傷的保護作用;在~1H NMR細胞代謝組學分析中,共鑒定出牛磺酸、精氨酸、脯氨酸等18個差異性代謝物,涉及�；撬岷蛠喤；撬岽x,精氨酸和脯氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等主要相關代謝通路,人參皂苷Rb_1通過上調損傷模型中的牛磺酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和蘇氨酸等15種代謝差異物,下調谷氨酸、β-羥基丁酸和鯊肌醇對SH-SY5Y細胞起到保護作用。結論:本文基于譜效學對人參抗AD活性成分進行了研究,篩選得到了同時具有AChE抑制活性和SH-SY5Y細胞保護活性的人參皂苷Rb_1、Rb_3和Rc,初步明確了人參中抗AD活性成分;基于分子對接和~1H NMR細胞代謝組學技術進一步闡明了人參的抗AD的分子作用機制,分子對接分析表明AChE的復合物中人參皂苷單體與AChE活性中心的特定氨基酸殘基形成氫鍵在其發(fā)揮活性中起到重要作用;基于~1H NMR細胞代謝組學研究揭示AD可能由于谷氨酸過度刺激導致氨基酸代謝紊亂而引起病理變化,而人參皂苷Rb_1主要通過影響多種能量及氨基酸代謝對SH-SY5Y細胞產生保護作用。研究結果為人參抗AD產品的開發(fā)應用提供了可靠的科學依據,也為其他中藥中抗AD有效成分的快速篩選和機制研究提供參考。
【學位單位】：長春中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R284.1

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本文編號：2817505