中藥具有數(shù)千年的醫(yī)藥文化歷史背景,因其良好的治療效果和較低的毒副作用,在國際上備受關(guān)注。但是,中藥在走向國際市場的道路上仍然面臨諸多阻礙,主要原因是其質(zhì)量不穩(wěn)定。農(nóng)藥殘留、重金屬污染以及霉菌毒素污染等問題是影響中藥質(zhì)量安全的主要源頭。為了確保中藥的質(zhì)量安全,促進(jìn)中藥的國際化發(fā)展,農(nóng)藥殘留、重金屬及霉菌毒素的檢測正逐漸成為廣大藥學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)。近年來,針對中藥中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要基于色譜和質(zhì)譜技術(shù),如氣相色譜法、高效液相色譜法、電噴霧解析電離質(zhì)譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等;針對中藥中重金屬的檢測方法主要基于光譜和質(zhì)譜技術(shù),如原子吸收分光光度法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法及X射線熒光光譜法等;針對中藥中霉菌毒素的檢測方法主要基于色譜技術(shù),如高效液相色譜法、免疫親和柱-高效液相色譜法等。以上所述的分析方法均具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,非常適合作為確證方法在實(shí)驗(yàn)室使用。然而,這些技術(shù)具有操作復(fù)雜,儀器昂貴以及樣品前處理耗時(shí)等不足之處,因此并不適合現(xiàn)場大批量樣本的快速篩選和現(xiàn)場檢測。化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence,CL)和熒光(fluorescence,FL)是靈敏度較高的光譜技術(shù),此外還具有線性范圍寬、儀器要求低、檢測時(shí)間短及操作簡單等優(yōu)勢,非常適合用于中藥中農(nóng)藥殘留、重金屬和霉菌毒素的現(xiàn)場快速篩查。本文將CL與免疫分析技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建了一種用于檢測中藥中農(nóng)藥殘留的免疫層析試紙條;將FL與免疫分析技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建了兩種基于免標(biāo)記策略的免疫分析方法,分別用于檢測中藥中的重金屬和霉菌毒素。具體研究內(nèi)容如下:1、基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光免疫層析法同時(shí)檢測甲基對硫磷和吡蟲啉本研究提出了一種基于CL動力學(xué)分辨策略的多組分免疫分析方法,可用于同時(shí)檢測中藥中的兩種農(nóng)藥殘留。研究中采用一種新型雙功能抗體(BfAb)作為唯一識別試劑,將其包被于試紙條的檢測線,基于該新型BfAb的多個(gè)不同抗原結(jié)合位點(diǎn),可在試紙條檢測線上同時(shí)特異性捕獲甲基對硫磷和吡蟲啉。以CL動力學(xué)特征具有顯著區(qū)別的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)作為CL信號探針,分別標(biāo)記甲基對硫磷半抗原和吡蟲啉半抗原,標(biāo)記后的兩種半抗原可與甲基對硫磷和吡蟲啉同時(shí)競爭BfAb上的結(jié)合位點(diǎn)。加入共反應(yīng)劑后,同時(shí)觸發(fā)具有閃光和輝光兩種動力學(xué)特點(diǎn)的CL反應(yīng)。前者CL信號在2.5秒時(shí)達(dá)到峰值,后者CL信號隨著時(shí)間的延長而持續(xù)增大,在300秒后兩者之間的信號干擾幾乎可以忽略不計(jì),為了保證本方法的檢測效率,選擇300秒作為后者的信號采集時(shí)間。在此多組分CL免疫方法中,甲基對硫磷和吡蟲啉的線性范圍均為0.1-250 ng/mL,檢測限均為0.06 ng/mL(3σ)。本研究構(gòu)建的同時(shí)檢測甲基對硫磷和吡蟲啉的免疫層析試紙條,檢測時(shí)長為22分鐘。該方法已成功應(yīng)用于當(dāng)歸和甘草的實(shí)際樣品檢測,回收率為95.6-117.0%。2、基于紫外降解技術(shù)構(gòu)建免標(biāo)記FL免疫分析方法特異性檢測銅本研究構(gòu)建了一種免標(biāo)記FL免疫分析方法用于檢測中藥中的重金屬(以銅為模型檢測物)。首先,將樣品中的銅離子(Cu~(2+))和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)充分反應(yīng),形成Cu~(2+)-EDTA絡(luò)合物。以Cu~(2+)-EDTA的單克隆抗體(McAb)作為分子識別試劑,免疫結(jié)合Cu~(2+)-EDTA絡(luò)合物。采用紫外(UV)光降解Cu~(2+)-EDTA-McAb免疫復(fù)合物,將Cu~(2+)高效解離出來。利用Cu~(2+)對CdSe/ZnS量子點(diǎn)(QDs)FL的猝滅效果,對Cu~(2+)進(jìn)行高特異性定量檢測,從而建立一種高效的免標(biāo)記FL免疫分析方法。本研究中,Cu~(2+)的檢測范圍為10-1000 ng/mL,檢測限為0.33 ng/mL(3σ)。此方法無需采用任何標(biāo)記技術(shù),具備簡單、高效、準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn),而且該方法可有效避免其它陽離子的干擾。已成功用于西洋參和靈芝中銅的檢測,回收率為81.9-128.6%,具有較大的應(yīng)用潛力。3、基于自增敏策略構(gòu)建免標(biāo)記熒光免疫分析方法檢測黃曲霉毒素B_1本研究基于黃曲霉毒素B_1(AFB_1)的FL自增敏效應(yīng),構(gòu)建了一種免標(biāo)記FL免疫分析方法,可用于特異性檢測中藥中的AFB_1。首先,將AFB_1的McAb修飾在羧基化磁珠上,實(shí)現(xiàn)對AFB_1的高效富集和快速分離。其次,將通過磁性分離得到的AFB_1-McAb的免疫復(fù)合物置于365 nm UV暗箱中進(jìn)行光衍生反應(yīng)2小時(shí),可顯著增強(qiáng)AFB_1的FL。然后,采集增強(qiáng)后的FL信號,實(shí)現(xiàn)AFB_1的特異性檢測。該免標(biāo)記FL免疫分析方法中AFB_1的檢測范圍為1.0-1000 ng/mL,檢測限為0.21ng/mL(3σ)。該方法已成功用于黃芪和丹參的實(shí)際樣品檢測,回收率為95.4%-107.7%。本方法操作簡便、檢測快速且成本低廉,在實(shí)際應(yīng)用中具有較好的發(fā)展前景。綜上所述,本研究將光譜技術(shù)(CL、FL)與免疫分析相結(jié)合,構(gòu)建了多種中藥農(nóng)藥殘留、重金屬以及霉菌毒素檢測的光學(xué)免疫分析方法。與傳統(tǒng)的ELISA和其它已報(bào)導(dǎo)的免疫分析方法相比,本文構(gòu)建的各種新方法有望實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藥殘留、重金屬及霉菌毒素進(jìn)行靈敏度更高,特異性更強(qiáng)的檢測。另外,本研究設(shè)計(jì)的傳感器所需設(shè)備簡單,操作簡單,成本低廉,有望實(shí)現(xiàn)檢測便攜化、小型化和自動化,為野外檢測和現(xiàn)場篩查分析工作提供了新的技術(shù)平臺。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文了應(yīng)對重金屬對中藥安全和人體健康的不良影響，構(gòu)建用于檢測重金屬污染的準(zhǔn)確、方便、靈敏的分析方法已刻不容緩。1.1.2.2 已有的檢測重金屬的分析方法目前檢測金屬離子的主要方法有原子吸收光譜法（AAS）[25]、X 射線熒光光譜法（XRF）[26]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[27]等。此類方法均具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，非常適合作為確證方法在實(shí)驗(yàn)室使用。然而，這類方法也存在一些難以克服的不足之處。例如，AAS 每次只能檢測一種元素，對于不同的元素需要建立多種測量方法，并且對操作者的專業(yè)要求較高。XRF 可用于直接分析成品, 但其精密度和重現(xiàn)性不高。ICP-MS 的檢測限較低，但易受一些輕元素（如 S、Ca、Fe、K、Se）的干擾，其方法可靠性有待加強(qiáng)。此外，這類方法還具有儀器龐大、操作繁瑣和分析成本高等缺點(diǎn)，因而不太適合作為現(xiàn)場方法使用。

不同的 CL 反應(yīng)其動力學(xué)特征各不相同，根據(jù)發(fā)光動力學(xué)特點(diǎn)的不同，發(fā)可分為閃光型，輝光型和震蕩型三種類型。閃光型 CL 反應(yīng)速度非�？欤瑤酌雰�(nèi)達(dá)到峰值（例如魯米諾 CL 體系）；而輝光型 CL 反應(yīng)進(jìn)行得很慢隨時(shí)間的推移逐漸增加，反應(yīng)時(shí)間達(dá)數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)不等（例如二氧雜環(huán)系）。第三類是震蕩型 CL 反應(yīng)，即 CL 信號出現(xiàn)周期性的增長和衰減（吡啶催化的 B-ZCL 體系）。常見的 CL 體系有魯米諾 CL 體系、二氧雜環(huán)系、吖啶酯 CL 體系以及過氧化草酸酯類 CL 體系等等[54-57]。魯米諾類化合物屬于酰肼類發(fā)光試劑，其結(jié)構(gòu)簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，易于合成溶液中溶解度較高，并且具有較高的發(fā)光量子產(chǎn)率。如圖 1-4 所示，魯米水溶液中被氧化成 3-氨基鄰苯二甲酸根離子，進(jìn)而在 425nm 左右發(fā)出藍(lán)]。該體系還可利用酶（例如辣根過氧化物酶，horseradishperoxidase,HRP屬離子（例如銅離子、鈷離子等）[61]等作為增敏劑，以增強(qiáng) CL 信號值。 CL 反應(yīng)，并可顯著影響 CL 信號的發(fā)光劑、共反應(yīng)劑、催化劑、增敏劑待檢物進(jìn)行定量檢測。上述的物質(zhì)亦可作為探針來標(biāo)記待檢測樣品的識構(gòu)建 CL 分析法。

59]。該體系還可利用酶（例如辣根過氧化物酶，horseradishperoxidase,HRP）[60]、重金屬離子（例如銅離子、鈷離子等）[61]等作為增敏劑，以增強(qiáng) CL 信號值。所有參與 CL 反應(yīng)，并可顯著影響 CL 信號的發(fā)光劑、共反應(yīng)劑、催化劑、增敏劑均可作為待檢物進(jìn)行定量檢測。上述的物質(zhì)亦可作為探針來標(biāo)記待檢測樣品的識別物，用以構(gòu)建 CL 分析法。圖 1-4 魯米諾類發(fā)光體系發(fā)光原理Fig. 1-4 The mechanism of the CLreaction of luminol.

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