[背景]肝纖維化是各種慢性肝病過度到肝硬化甚至肝癌的必經(jīng)之路,因此盡早進(jìn)行診斷治療對(duì)于防止疾病惡化、提高患者生存率以及改善患者生活質(zhì)量具有重要意義。目前大量的文獻(xiàn)證實(shí)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。當(dāng)肝臟受到損傷因子刺激時(shí),靜息的HSC會(huì)激活轉(zhuǎn)變成活化型HSC,自身不斷增殖分泌大量ECM,此外還持續(xù)釋放多種趨化因子損傷周邊的肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞等,進(jìn)一步加劇肝臟病理狀態(tài),所以靶向抑制HSC活化已經(jīng)成為改善以及治療肝纖維化的關(guān)鍵策略。發(fā)掘靶向抑制HSC活化進(jìn)而緩解肝纖維化進(jìn)程的安全高效的藥物目前是抗肝纖維化治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題致力于抗肝纖維化天然產(chǎn)物藥物的研究,發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物具有良好的改善肝纖維化的療效。而嵩甲醚(Artemether,ART)作為臨床一線抗瘧藥物,開發(fā)其抗肝纖維化這一新的藥理活性,將為其相關(guān)臨床疾病的治療帶來曙光。本研究旨在明確蒿甲醚對(duì)肝纖維化的改善作用,并闡明其作用機(jī)制。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為ART作為抗肝纖維化藥物提供數(shù)據(jù)支撐,為ART的作用機(jī)制以及潛在靶點(diǎn)提供了嶄新的思路和方向。[方法]1.臨床樣本檢測(cè)從南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院獲取28例臨床肝臟活檢、肝硬化以及肝癌患者肝臟樣本,免疫熒光、馬松染色以及Real-time PCR考察BRD7分子與肝臟疾病進(jìn)程的關(guān)系。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)80只雄性ICR小鼠隨機(jī)分成10組(每組8只):正常對(duì)照組、CC14造模組、CC14+空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組、ART低劑量組(5 mg/kg)、ART中劑量組(10 mg/kg)、ART高劑量組(20 mg/kg)、ART(10 mg/kg)+ 空轉(zhuǎn)質(zhì)粒組、BRD7 shRNA組、ART(10 mg/kg)+BRD7 shRNA組、秋水仙堿組。肝臟宏觀檢查、蘇木精-伊紅染色、馬松染色、天狼星紅染色直觀考察小鼠肝臟結(jié)構(gòu)變化,谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)評(píng)估小鼠肝損傷情況,羥脯氨酸以及肝纖四項(xiàng)(透明質(zhì)酸、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原)試劑盒檢測(cè)評(píng)估小鼠纖維化程度,Real-time PCR、western blot、免疫組化以及免疫熒光考察小鼠肝臟HSC活化(a-SMA、Fibronectin、Collagen 1)和促纖維化(PDGF-βR、EFGR)指標(biāo)的水平;此外,免疫熒光以及普魯士藍(lán)染色觀察小鼠肝臟鐵死亡的發(fā)生。3.體外實(shí)驗(yàn)選取人源性肝星狀細(xì)胞LX2、正常肝細(xì)胞LO2、肝癌細(xì)胞HepG2以及SMMC7721作為體外研究對(duì)象,MTT和臺(tái)盼藍(lán)染色考察HSC細(xì)胞活力以及死亡情況;免疫熒光、western blot、Real-time實(shí)驗(yàn)考察HSC活化指標(biāo)的表達(dá);臺(tái)盼藍(lán)染色、PGSK染色、電鏡觀察、試劑盒檢測(cè)評(píng)估HSC鐵死亡的發(fā)生;Western blot、免疫共沉淀、免疫熒光檢測(cè)BRD7的蛋白表達(dá)以及P53、BRD7分子的結(jié)合情況。[結(jié)果]臨床肝臟樣本的馬松、免疫熒光染色以及Real-time PCR結(jié)果顯示與正常肝組織相比,隨著肝臟病程加重,BRD7的表達(dá)與a-SMA的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。體內(nèi)研究結(jié)果顯示,ART可以顯著改善CC14所致的肝臟病理改變、膠原沉積、HSC細(xì)胞的活化以及促纖維化因子的表達(dá)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),ART可以選擇性地促進(jìn)活化型HSC細(xì)胞表達(dá)鐵死亡關(guān)鍵指標(biāo)(SLC2A11、Ptgs2、鐵離子)并促使其發(fā)生鐵死亡,這提示ART對(duì)肝纖維化的改善作用與其介導(dǎo)HSC細(xì)胞鐵死亡密切相關(guān)。深入機(jī)制探討發(fā)現(xiàn)ART可以增強(qiáng)肝臟BRD7的表達(dá),而BRD7 shRNA可以削弱ART促進(jìn)HSC鐵死亡以及抗肝纖維化作用,這表明BRD7分子極有可能是ART發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ART可以劑量依賴性地降低HSC活化指標(biāo)蛋白以及基因水平的表達(dá)。同時(shí),ART可以誘導(dǎo)HSC呈現(xiàn)出鐵死亡的表型:鐵離子聚集、脂質(zhì)過氧化物過載、抗氧化系統(tǒng)失調(diào)以及線粒體皺縮,使用鐵死亡抑制劑Fer-1反向驗(yàn)證證明ART的確通過介導(dǎo)鐵死亡抑制HSC活化。深入機(jī)制探討發(fā)現(xiàn)ART可以明顯提高BRD7的表達(dá),介導(dǎo)BRD7與P53綁定入核并調(diào)控下游鐵死亡關(guān)鍵因子SLC 7A11的轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)鐵死亡進(jìn)程。而這一作用則能被BRD7干擾顯著削弱,結(jié)果表明BRD7-P53-SLC7A11通路介導(dǎo)的鐵死亡是ART抗肝纖維化的基礎(chǔ)。[結(jié)論]本研究體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)首先證明ART確實(shí)具有抗肝纖維化的療效,而且這一作用與ART誘導(dǎo)活化型HSC發(fā)生鐵死亡密切相關(guān)。此外,通過軟件數(shù)據(jù)分析以及臨床樣本、小鼠纖維化肝臟樣本和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)BRD7極有可能與纖維化進(jìn)程呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ART可以促進(jìn)BRD7的高表達(dá),而且ART誘導(dǎo)的鐵死亡依賴于BRD7介導(dǎo)的P53入核。本實(shí)驗(yàn)為ART作為抗肝纖維化藥物提供數(shù)據(jù)支撐,而且為靶向BRD7分子抗纖維化治療提供研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖１－３邋Ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ主要調(diào)控通路逡逑Ｆｉｇ．１－３邋Ｍａｊｏｒ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｏｆ?

－４邋Ｔｈｅ邋ｓｏｕｒｃｅ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｏｒｍｕｌａ邋ｏｆ邋ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ邋（Ｗｕ邋Ｊ，Ｌｉ邋Ｈ，Ｌｉ邋Ｍ．邋Ｅｆｆｅｃｔｅｔｈｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，邋ａｖｏｖｔｏｓｉｓ，邋ａｎｄ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：邋ｐｏｔｅｎｃａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｐｓｏｒｉａｓｉｓ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．邋Ｉｎｔ邋Ｊ邋Ｃｌｉｎ邋Ｅｘｖ邋Ｍｅｄ．邋２０１５；邋８（５）：７０６９－７０７８）［４７］逡逑本課題科學(xué)問題的提出與內(nèi)容逡逑我們?cè)谇捌谶M(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，免疫熒光以及ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示蒿甲明顯降低活化型ＨＳＣ中ａ－ＳＭＡ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ以及Ｃｏｌｌａｇｅｎ邋１的表達(dá)，顯示蒿甲醚確實(shí)具有抗肝纖維化的潛能。更有趣的是，青蒿素類藥物過氧橋這一特殊結(jié)構(gòu)，被公認(rèn)為是鐵死亡的誘導(dǎo)劑［５２－５３］。但是蒿甲醚調(diào)控ＨＳＣ鐵死亡發(fā)揮抗肝纖維化作用以及具體分子機(jī)制的探討目前未見報(bào)道。逡逑為此，本論文采用動(dòng)物疾病模型以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的手段，首先采用體內(nèi)證蒿甲醚對(duì)經(jīng)典ＣＣ１４致肝纖維化模型具有明顯緩解作用以及對(duì)活細(xì)胞具有顯著抑制作用；接著證實(shí)蒿甲醚抗肝纖維化的作用確實(shí)與

邐第二章蒿甲醚體內(nèi)外顯著緩解肝纖維化狀況周（Ｆｌｇ．邋２－１）。空白對(duì)照組：接受橄欖油腹腔注射；模型組：接受１０％邋ＣＣ１４腹逡逑腔注射８周（每只小鼠０．５ｍｌ／１００ｇ），每周三次【１５］；蒿甲醚低、中、高劑量給藥逡逑治療組：除了接受１０％邋ＣＣ１４腹腔注射８周外，在第５－８周期間同時(shí)每天接受低逡逑（５ｍｇ／ｋｇ）、中（１０ｍｇ／ｋｇ）、高（２０ｍｇ／ｋｇ）齊ｌｊ量的蒿甲醚腹腔注射；陽性藥秋水逡逑仙堿（０．１邋ｍｇ／ｋｇ）治療組：除了接受１０％邋ＣＣＵｆ腔注射８周外，在第５－８周期逡逑間同時(shí)每天接受秋水仙堿腹腔注射。在末次給藥處理后，對(duì)所有小鼠進(jìn)行１天逡逑的禁食不禁水的操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每只小鼠稱重并進(jìn)行眼眶取血，采血完畢逡逑后剝離完整肝臟以及記錄肝臟重量，用于計(jì)算肝指數(shù)（％）。獲取的小鼠血液室逡逑溫靜置過夜后，離心（２０００邋ｒ／ｍｉｎ，邋２０邋ｍｉｎ）所得的上層血清，－２０°Ｃ凍存，用于逡逑后續(xù)血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)；分離的肝臟樣本，分成若干部分，部分在１０％福爾馬逡逑林中性緩沖液固定于室溫保存用于后續(xù)切片染色實(shí)驗(yàn)，部分在－８０°Ｃ或液氮中逡逑快速冷凍保存用于后續(xù)的試劑盒、ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ以及ＰＣＲ檢測(cè)。逡逑

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9 王潤(rùn)田;崔o

本文編號(hào)：2817040