研究背景動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是多種心腦血管疾病的主要病理基礎,嚴重威脅著人類的生命健康,是發(fā)達國家人群的主要死亡原因之一,在我國,尤其是近年來,AS的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。因而,對于AS發(fā)病機制及治療藥物的研究尤顯重要,但動脈粥樣硬化的致病因素和發(fā)病機制極其復雜,且迄今為止,仍未有確切的學說證明其機制。19世紀80年代以來,關于AS發(fā)病機制學說眾多,主要包括脂質(zhì)浸潤、內(nèi)皮損傷、平滑肌細胞異常增殖等等。而隨著研究的逐漸深入,炎癥損傷和氧化應激逐漸成為人們公認的較為重要的發(fā)病機制,也是眾多學者們研究的重點。關于治療動脈粥樣硬化的藥物,目前應用最廣泛的為他汀類藥物,其對于血脂的調(diào)節(jié)效果顯著,尤其是在降低LDL方面,且有研究表明,他汀類藥物除能夠有效降低血脂外,還具有抗炎、抗氧化、修復血管和抑制血小板聚集等作用。但隨著臨床應用的深入,研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物具有肝毒性、肌肉損傷、胃腸道反應及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等不良反應。而中藥復方作為一種多成分、多靶點的傳統(tǒng)藥物,能夠有效減少機體服藥后的不良反應,降低藥物耐藥性發(fā)生率,且與動脈粥樣硬化發(fā)病機制的多樣性相吻合,在治療AS上,具有一定優(yōu)勢。從中醫(yī)角度來講,動脈粥樣硬化病因為氣血陰陽不足,痰瘀熱毒互結,阻滯脈絡,臨床上的治療手段多以活血化瘀,化痰解毒為主。三黃瀉心湯是臨床經(jīng)典小復方,始載于《金匱要略》,由大黃,黃連和黃芩組成,主要作用為清熱解毒,活血化瘀。課題組在前期對于三黃瀉心湯炮制配伍九種組分的藥效學作用篩選實驗中發(fā)現(xiàn),組方7對于血瘀大鼠具有良好的治療作用,故而本實驗以三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方(組方7)為受試藥物,研究其對AS的治療作用及其作用機制。研究內(nèi)容1.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對大鼠動脈粥樣硬化的作用采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合維生素D3注射及免疫反應激發(fā)的方法復制大鼠動脈粥樣硬化模型,分為對照、模型、陽性藥及三黃瀉心湯大、中、小劑量6組。造模8周,給藥4周。于12周末,腹主動脈取血,測定以下指標:總膽固醇(Total Cholesterol,T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、超敏 C 反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)、白介素 8(interleukin-8,IL-8)、白介素 18(interleukin-18,IL-18)、6-酮-前列腺素 1a(6-keto-prostaglandin F1a,6-keto-PGF!a)、內(nèi)皮素(Endothelin,ET)、血栓烷素 B2(Thromboxane B2,TXB2)。同時固定其主動脈,HE染色,顯微鏡下觀察血管的病理變化情況。2.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對HUVECs的保護作用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umilical vein endothelial cell,HUVECs),MTT法測定三黃瀉心湯最大無毒濃度,以200μg· mL-1 Ox-LDL建立細胞損傷模型[],測定細胞存活率;采用放免法測定ET、6-keto-PGF1α、TXB2,分光光度法測定MDA、SOD、NO,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細胞上清液中細胞間粘附分子-1(Intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)、人血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的含量。以 60 ng·mL-1 TNF-α 造模,測定細胞存活率,ELISA 檢測細胞上清液中的 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-1 β、IL-6、IL-8水平,分光光度法測定NO的含量。3.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方抗AS作用機制的研究體外培養(yǎng)HUVECs,以200μg·mL-1 Ox-LDL建立細胞氧化應激損傷模型,ELISA法測定細胞上清液ROS含量,流式細胞儀測定細胞凋亡率及線粒體膜電位變化,Western Blot 法檢測凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表達情況。以60 ng·mL-1 TNF-α造成細胞炎癥損傷模型,Western Blot法檢測炎癥相關蛋白 VE-Cadherin、E-Selectin、ICAM-1、VCAM-1 的表達水平。實驗結果1.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對大鼠動脈粥樣硬化的作用1)對血脂水平的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠有效降低TC、TG、LDL-C水平、升高HDL-C水平。2)對抗氧化作用的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對于升高SOD活性,降低MDA活性具有一定的作用。3)對抗炎作用的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠降低Hs-CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎因子的含量。4)對內(nèi)皮功能的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對于升高NO、6-keto-PGF1α含量和降低ET、TXB2含量具有顯著作用。5)對血管病理形態(tài)結構的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠減少脂質(zhì)沉積及膽固醇結晶,改善鈣化程度。2.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對HUVECs的保護作用1)藥物最大無毒濃度及給藥量:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方的最大無毒濃度為62.5μg·mL-1。選取62.5、31.25、15.625κg·mL-1三個濃度作為細胞給藥濃度。2)對細胞存活率的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠明顯提高由Ox-LDL和TNF-α誘導損傷的HUVECs的存活率。3)對細胞分泌活性物質(zhì)含量的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠顯著降低由 Ox-LDL 誘導損傷的 HUVECs 中 MDA、ET、TXB2、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量,升高SOD、NO、6-keto-PGF1α含量。并且明顯降低由TNF-α誘導損傷的 HUVECs 中 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-1 β、IL-6、IL-8 的含量,升高NO含量。3.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方抗AS作用機制的研究1)抗氧化應激引起的凋亡:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠減少ROS的分泌,降低細胞凋亡率,調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白表達(減少Bax、caspase-3、caspase-9表達量并增加Bcl-2的表達量)。2)抗炎作用:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方可有效降低炎癥相關蛋白(VE-Cadherin,E-Selectin、ICAM-1、VCAM-1)的表達量。結論1.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方可從調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎、改善血管內(nèi)皮細胞功能等多方面發(fā)揮保護AS大鼠的作用。2.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠有效保護由Ox-LDL和TNF-α誘導損傷的HUVECs,并且該組方可減少炎癥相關蛋白的表達從而抑制炎癥發(fā)展,亦可通過調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白表達從而抑制由氧化應激引起的內(nèi)皮細胞凋亡,其保護HUVECs的機制可能與上述作用相關。
【學位單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

３實驗結果逡逑３．１藥物最大無毒濃度的篩選逡逑對數(shù)生長期細胞如圖２－１所示，單個細胞生長如多角形或梭形，彼此間的界逡逑限清晰，胞漿豐富，當生長成片后，成典型的鋪路石子狀。逡逑ｘ２００逡逑圖２－１對數(shù)生長期ＨＵＶＥＣｓ逡逑如表２－１和圖２－２所示，隨著三黃瀉心湯濃度的增加，對ＨＵＶＥＣｓ的增殖作逡逑用不斷增強，并隨藥物濃度增加呈現(xiàn)增長趨勢，當三黃瀉心湯濃度達到逡逑ＷｐｇＴｎＬ－１時，出現(xiàn)了明顯的抑制，與對照組有顯著性差異，因此，三黃瀉心湯逡逑作用ＨＵＶＥＣｓ２４ｈ的最大無毒濃度為６２．５ｐｇ．ｍｌＡ選取６２．５０、３１．２５、１５．６３三逡逑個濃度作為細胞給藥濃度。逡逑３７逡逑

３實驗結果逡逑３．１藥物最大無毒濃度的篩選逡逑對數(shù)生長期細胞如圖２－１所示，單個細胞生長如多角形或梭形，彼此間的界逡逑限清晰，胞漿豐富，當生長成片后，成典型的鋪路石子狀。逡逑ｘ２００逡逑圖２－１對數(shù)生長期ＨＵＶＥＣｓ逡逑如表２－１和圖２－２所示，隨著三黃瀉心湯濃度的增加，對ＨＵＶＥＣｓ的增殖作逡逑用不斷增強，并隨藥物濃度增加呈現(xiàn)增長趨勢，當三黃瀉心湯濃度達到逡逑ＷｐｇＴｎＬ－１時，出現(xiàn)了明顯的抑制，與對照組有顯著性差異，因此，三黃瀉心湯逡逑作用ＨＵＶＥＣｓ２４ｈ的最大無毒濃度為６２．５ｐｇ．ｍｌＡ選�。叮玻担啊ⅲ常保玻�、１５．６３三逡逑個濃度作為細胞給藥濃度。逡逑３７逡逑

注：＊ＶＳ模型組，ｐ＜０．０１逡逑３．１．２線粒體膜電位檢測逡逑如圖３－２和圖３－３所示，與空白組比較，模型組低膜電位細胞比例明顯增大逡逑（／Ｋ０．０１）；與模型組比較，各給藥組低膜電位細胞比例明顯減�。ǎ穑迹埃埃保�。逡逑Ｊ邐＾邋９逡逑？令益邋ｑｉ

本文編號：2816995