背景和目的:環(huán)孢素A(CsA)是一種免疫抑制劑,常用于器官和組織移植后的抗免疫排斥反應(yīng),但由于其誘導(dǎo)的高膽紅素血癥、高膽固醇血癥以及膽汁淤積性肝損傷等不良反應(yīng),使用往往受到限制。臨床研究表明,中藥復(fù)方茵梔黃(YZH)可增強(qiáng)膽紅素和膽汁酸的清除,廣泛用于新生兒黃疸或膽汁淤積癥。本研究的目的是確定茵梔黃對(duì)環(huán)孢素A誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。方法:1.動(dòng)物造模:雄性SD大鼠32只,將大鼠按體重隨機(jī)分為正常組、環(huán)孢素A組、茵梔黃組和熊去氧膽酸組,每組8只。正常組:口服灌胃給予大鼠0.5%CMC-Na混懸液;環(huán)孢素A組:口服灌胃給予環(huán)孢素A(CsA,30 mg·kg~(-1))混懸液,每日兩次,連續(xù)10天進(jìn)行給藥處理;茵梔黃處理組:口服灌胃給予茵梔黃口服液(YZH,5 mL·kg~(-1)),每日兩次,同時(shí)口服灌胃給予環(huán)孢素A混懸液,連續(xù)10天進(jìn)行給藥處理;熊去氧膽酸組:口服灌胃給予熊去氧膽酸(UDCA,25 mg·kg~(-1))混懸液,每日兩次,同時(shí)口服灌胃給予環(huán)孢素A混懸液,連續(xù)10天進(jìn)行給藥處理。2.檢測(cè)藥效學(xué)指標(biāo):(1)檢測(cè)大鼠血清生化指標(biāo)TBIL、DBIL、IBIL、TBA、ALT和AST的水平,評(píng)估大鼠肝功能的變化;(2)采用蘇木精伊紅染色(HE染色)觀察各組大鼠肝組織的病理學(xué)改變;(3)檢測(cè)肝臟中氧化指標(biāo)如超氧化物歧化酶(SOD),還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的水平變化。3.建立LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠血清中15種膽汁酸的含量的分析方法,并且對(duì)Control組、CsA組、YZH組和UDCA組大鼠血清中膽汁酸的含量進(jìn)行測(cè)定和分析。4.采用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)大鼠肝臟中Fxr、Mrp2、Bsep、Ntcp、Oatp2、Ugt1a1和Cyp7a1的基因和蛋白表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)(IHC)用于測(cè)定大鼠肝組織中Bsep和Mrp2的表達(dá)水平。5.建立茵梔黃及其有效成分京尼平苷酸(GPA)、黃芩苷(BA)和綠原酸(CHA)干預(yù)環(huán)孢素A誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞模型,采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)LO2細(xì)胞中FXR、MRP2、BSEP、NTCP、OATP2、CYP7A1和UGT1A1基因和蛋白表達(dá)水平,探究茵梔黃及其有效成分對(duì)這些代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響。結(jié)果:茵梔黃(YZH)能夠顯著降低環(huán)孢素A(CsA)誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠的血清生化指標(biāo)ALT、AST、TBIL、DBIL和TBA水平,并且顯著增加大鼠肝臟SOD活力和GSH水平。此外,HE實(shí)驗(yàn)表明,YZH能夠顯著減輕肝細(xì)胞壞死和退行性變化,膽管增生以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),這表明YZH能夠保護(hù)CsA誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷。本實(shí)驗(yàn)成功建立了LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠血清中15種膽汁酸成分的分析方法,并且對(duì)Control組、CsA組、YZH組和UDCA組大鼠血清中膽汁酸的含量進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CsA能夠顯著增加大鼠血清中膽汁酸成分如CA、GCDCA、TCDCA和TCA的含量,同時(shí)顯著降低血清中UDCA的含量。與CsA組相比,YZH能夠顯著增加大鼠血清中UDCA的含量,并且降低CA、GCDCA、TCA和GCA的含量。蛋白和基因分析顯示CsA能夠顯著降低大鼠肝臟中核受體Fxr的表達(dá),并且降低Mrp2、Bsep、Ntcp和Oatp2轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的蛋白表達(dá),同時(shí)CsA也能夠顯著增加膽汁酸合成酶Cyp7a1的蛋白表達(dá)并降低膽紅素代謝酶Ugt1a1的蛋白表達(dá)。相比之下,YZH顯著增加Fxr的蛋白表達(dá),同時(shí)顯著增加外排轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2和Bsep的蛋白表達(dá),抑制Cyp7a1的蛋白表達(dá)并且增加Ugt1a1的蛋白表達(dá)。此外,體外實(shí)驗(yàn)證明CsA處理的LO2細(xì)胞中FXR、MRP2、BSEP、NTCP、OATP2、UGT1A1和CYP7A1蛋白表達(dá)水平的變化與大鼠肝臟中的蛋白變化趨勢(shì)一致。YZH顯著增加FXR、MRP2、BSEP和OATP2的表達(dá),并且降低CYP7A1酶和增加UGT1A1酶的表達(dá)。另外,LO2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)京尼平苷酸,黃芩苷和綠原酸是YZH的活性藥物成分,能夠不同程度地促進(jìn)或抑制FXR、MRP2、BSEP、NTCP、OATP2、UGT1A1和CYP7A1的表達(dá)。結(jié)論:茵梔黃對(duì)環(huán)孢素A誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷大鼠具有保肝作用,對(duì)膽汁淤積及其引起的肝損傷有顯著的保護(hù)作用。其機(jī)制可能是YZH通過調(diào)節(jié)核受體FXR,及其下游相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體MRP2、BSEP、NTCP和OATP2以及代謝酶CYP7A1和UGT1A1的表達(dá),改善膽汁酸和膽紅素的體內(nèi)蓄積,從而預(yù)防和治療CsA誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷。此外,京尼平苷酸,黃芩苷和綠原酸是茵梔黃發(fā)揮藥理作用的有效成分,能夠通過調(diào)節(jié)膽汁酸和膽紅素代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮保肝作用�？偠灾�,茵梔黃作為傳統(tǒng)中藥復(fù)方,可能成為預(yù)防和治療CsA誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷的潛在藥物。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1-1 茵梔黃對(duì)環(huán)孢素 A 誘導(dǎo)的大鼠血清生化指標(biāo)的影響注：空白組（Control），環(huán)孢素 A組（CsA），茵梔黃組（YZH+CsA），熊去氧膽酸組（UDCA+CsA）；與空白組相比*P<0.05，**P<0.01，**P<0.01；與環(huán)孢素 A 組相比#P<0.05，##P<0.01。4.2 H&E 染色觀察茵梔黃對(duì)環(huán)孢素 A 誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用正常組大鼠肝臟組織 H&E 染色觀察顯示中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞未見水腫變性（圖 1-2 A）；與正常組肝臟形態(tài)相比，CsA 處理的大鼠中清楚地觀察到肝細(xì)胞水腫，脂肪變性，肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膽汁淤積（圖 1-2 B）；而 YZH 或 UDCA 處理的大鼠肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)得到明顯改善，減輕膽管增生和膽汁淤積（圖 1-2 C，D）。

圖 1-1 茵梔黃對(duì)環(huán)孢素 A 誘導(dǎo)的大鼠血清生化指標(biāo)的影響注：空白組（Control），環(huán)孢素 A組（CsA），茵梔黃組（YZH+CsA），熊去氧膽酸組（UDCA+CsA）；與空白組相比*P<0.05，**P<0.01，**P<0.01；與環(huán)孢素 A 組相比#P<0.05，##P<0.01。4.2 H&E 染色觀察茵梔黃對(duì)環(huán)孢素 A 誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用正常組大鼠肝臟組織 H&E 染色觀察顯示中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞未見水腫變性（圖 1-2 A）；與正常組肝臟形態(tài)相比，CsA 處理的大鼠中清楚地觀察到肝細(xì)胞水腫，脂肪變性，肝細(xì)胞壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膽汁淤積（圖 1-2 B）；而 YZH 或 UDCA 處理的大鼠肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)得到明顯改善，減輕膽管增生和膽汁淤積（圖 1-2 C，D）。

熊去氧膽酸（UDCA）處理組大鼠肝臟中 MDA 含量較環(huán)孢素 A 處理組顯著降低（P<0.01），如下圖1-3 所示。圖 1-3 茵梔黃對(duì)環(huán)孢素 A 誘導(dǎo)的大鼠肝臟中 SOD、GSH 和 MDA 的影響注：空白組（Control），環(huán)孢素 A組（CsA），茵梔黃組（YZH+CsA），熊去氧膽酸組（UDCA+CsA）；與空白組相比*P<0.05，**P<0.01；與環(huán)孢素 A 組相比#P<0.05。5.討論CsA 是一種有效且強(qiáng)大的免疫抑制劑，能夠抑制 T 細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在臨床治療過程中可能會(huì)導(dǎo)致高膽紅素血癥、高膽汁酸血癥以及膽汁淤積性肝損傷，因此其使用往往受到限制[3-5]。盡管進(jìn)行了廣泛的研究，但 CsA 誘導(dǎo)的肝毒性的具體機(jī)制仍不清楚。茵梔黃具有利濕和退黃之效

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