背景及目的:目前,由于臨床上抗感染疾病的治療對(duì)于抗生素類(lèi)藥物的過(guò)度依賴(lài)甚至濫用,導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn),甚至出現(xiàn)了對(duì)多種抗生素耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”。使得臨床上感染性疾病的治療非常棘手,細(xì)菌耐藥性問(wèn)題亟待解決。探究出新思路和新途徑來(lái)尋找新的抗菌藥物,從而以其控制和降低細(xì)菌的耐藥性顯得十分的迫切。在抗生素尚未問(wèn)世之前,我國(guó)預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病,多予以具有清熱解毒功效的中草藥進(jìn)行治療。因此,在清熱解毒類(lèi)中草藥中篩選有效的天然抑菌藥物,為對(duì)抗和控制細(xì)菌耐藥性問(wèn)題開(kāi)辟一種新的可行性途徑,引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的日益關(guān)注。虎杖藥用歷史悠久,為具有清熱解毒功效的傳統(tǒng)中藥�，F(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展表明其具有抗菌、抗炎、抗病毒。在前期篩選具有抑菌作用中草藥時(shí)發(fā)現(xiàn)虎杖的水煎液在體外具有較強(qiáng)抑菌活性。其中,虎杖中的大黃素、虎杖苷為是其發(fā)揮抑菌藥效的主要活性成分。本研究主要目的是利用正交設(shè)計(jì)并聯(lián)用改良式明膠法優(yōu)化虎杖中的抑菌活性成分大黃素、虎杖苷的提取與除鞣工藝;優(yōu)化RP-HPLC法測(cè)定虎杖苷、大黃素含量的色譜條件;在優(yōu)化的最佳工藝條件下再進(jìn)一步對(duì)虎杖提取液進(jìn)行體外抑菌藥效學(xué)的研究。方法:1.采用水提醇沉法對(duì)虎杖中抑菌活性成分大黃素、虎杖苷進(jìn)行提取。正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化虎杖提取工藝,選擇L_9(3~4)正交表安排試驗(yàn),對(duì)影響虎杖有效成分提取的取次數(shù)、時(shí)間、料液比及藥用醇濃度四因素進(jìn)行綜合考察。2.采用改良式明膠法去除虎杖藥液中的鞣質(zhì)成分,設(shè)無(wú)明膠組與1%、2%、3%明膠除鞣組,分析除鞣前后大黃素、虎杖苷含量與藥液澄明度變化。3.RP-HPLC法對(duì)虎杖提取的指標(biāo)成分大黃素、虎杖苷進(jìn)行含量測(cè)定分析。4.將優(yōu)化的最佳工藝條件下提取的虎杖藥液對(duì)試驗(yàn)菌大腸桿菌(G~-)、銅綠假單胞菌(G~-)、金黃色葡萄球菌(G~+)及真菌白色念珠菌進(jìn)行體外抑菌活性研究。以市售潔爾陰洗液(國(guó)藥準(zhǔn)字Z10930008)作為抑菌實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥。二倍稀釋法測(cè)定虎杖藥液對(duì)四種致病菌最小抑菌濃度(MIC);繪制虎杖藥液對(duì)四種菌生長(zhǎng)抑制量效曲線(xiàn);采用UV法與電導(dǎo)率法測(cè)定經(jīng)虎杖藥液作用后金葡菌的培養(yǎng)液在波長(zhǎng)260nm與280nm吸光度與電導(dǎo)率的變化;藥敏紙片法(K-B法)測(cè)定虎杖藥液對(duì)四種菌的抑菌圈(IDZ)大小;菌藥共孵育-平皿法測(cè)定虎杖抑菌作用起效所需共孵育的時(shí)間。結(jié)果:1.正交設(shè)計(jì)聯(lián)用改良式明膠法優(yōu)化虎杖中大黃素、虎杖苷的提取的最佳工藝組合為:A_2B_3C_3D_3,即料液比為1:10(g/ml)、提取3次、提取時(shí)間為90min、80%藥用醇進(jìn)行醇沉;虎杖的最佳除鞣工藝條件為:2%明膠濃度的改良式明膠法。2.稀釋法測(cè)定虎杖抑菌的MIC結(jié)果:對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌的MIC值分別為12.5、25、25、6.25mg/ml;3.在2、1、1/2、1/4、1/8MIC五種不同虎杖藥液濃度下,四種菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制作用,其中2MIC的虎杖藥液濃度明顯抑制了四種菌的生長(zhǎng),使其不能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)曲線(xiàn)平緩,呈非典型生長(zhǎng);在1、1/2、1/4、1/8MIC虎杖藥液濃度的作用下四種菌的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制作用,雖仍可以進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,但由于抑菌作用延緩和降低了其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的進(jìn)程;加入虎杖藥液的金葡菌培養(yǎng)液,隨抑菌作用時(shí)間延長(zhǎng)測(cè)得培養(yǎng)液電導(dǎo)率值、OD_(260)與OD_(280)值不斷增大,均高于未加藥的對(duì)照組;4.K-B法測(cè)定虎杖藥液對(duì)E.coli、P.aer、S.aur、C.alb的IDZ值分別為18±0.2、14±0.2、17±0.2、19±0.2mm;潔爾陰洗液的IDZ值分別為18±0.2、11±0.2、17±0.2、18±0.2mm;5.菌藥共孵育結(jié)果:虎杖藥液對(duì)E.coli、P.aer、S.aur、C.alb分別在共孵育12、12、8、8h為明顯抑菌起效時(shí)間;潔爾陰洗液明顯抑菌起效的菌藥共孵育時(shí)間分別為12、12、8、12h。結(jié)論:1.正交設(shè)計(jì)聯(lián)用改良式明膠法優(yōu)選出的最佳提取與除鞣工藝條件穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單、虎杖藥液澄明度、穩(wěn)定性好,虎杖中抑菌活性成分大黃素、虎杖苷提取率高。2.虎杖體外抑菌活性研究的四項(xiàng)抑菌活性指標(biāo)顯示虎杖水煎液在對(duì)四種常見(jiàn)致病菌均具有明顯的抑菌作用;其體外抑菌活性與市售的國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)潔爾陰洗液相比活性相當(dāng)或更優(yōu)。3.虎杖抑菌作用機(jī)制初步研究結(jié)果表明,虎杖對(duì)金葡菌的抑菌作用可能是通過(guò)破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或功能,導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變,使得菌體細(xì)胞中的無(wú)機(jī)鹽離子、核酸與蛋白質(zhì)等大分子發(fā)生外滲,導(dǎo)致菌體的正常形態(tài)和代謝過(guò)程受到破壞和影響,從而起到抑菌或殺菌作用。4.研究采用的藥敏試驗(yàn)方法菌藥共孵育-平皿法可在近似模擬在人體內(nèi)較適宜pH值液體環(huán)境下,藥液與細(xì)菌共孵育過(guò)程中直接接觸發(fā)生抑菌相互作用,可得出藥液對(duì)不同試驗(yàn)菌出現(xiàn)明顯抑菌作用共孵育所需的時(shí)間。具有結(jié)果直觀(guān)、準(zhǔn)確、快速、可靠的優(yōu)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其可作為研究液體類(lèi)抗菌藥物體外抑菌作用的一種適用的方法。虎杖體外抑菌活性結(jié)果顯示其是一味極具有研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值的抗菌作用中藥。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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