發(fā)布時(shí)間：2020-09-10 11:46

　　 目的以牛Ⅱ型膠原加弗氏完全佐劑建立膠原誘導(dǎo)型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型,觀察黃芪桂枝五物湯(HGW)對(duì)模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)病理、足趾腫脹度、血流變、滑膜細(xì)胞凋亡、相關(guān)細(xì)胞因子和JAK3/STAT3信號(hào)通路等的影響,以探討黃芪桂枝五物湯(HGW)對(duì)膠原誘導(dǎo)型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及其機(jī)制。方法SPF級(jí)SD雄性大鼠72只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為2組:N組(12只)和CIA組(60只)。將牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑1:1充分乳化,即膠原濃度為1 g·L~(-1)。于CIA組每只大鼠右后足爪、背部、尾根三點(diǎn)各皮下注射乳化劑0.1 mL,7 d后以0.1ml乳化劑加強(qiáng)免疫一次,以免疫加強(qiáng)當(dāng)天為d 1。致炎后d 15,將CIA組隨機(jī)分為五組:CIA組、黃芪桂枝五物湯低劑量(HGW-L)組、黃芪桂枝五物湯中劑量(HGW-M)組、黃芪桂枝五物湯高劑量(HGW-H)組及Tofacitinib(TFN)組。將黃芪桂枝五物湯常規(guī)煎煮并濃縮藥物,按10 mL·kg~(-1)體質(zhì)量ig給藥。HGW-L、HGW-M、HGW-H組藥物劑量分別為16、32、64 g·m L~(-1),相當(dāng)于臨床常人用量的3、6、12倍,TFN藥物劑量為15 mg·kg~(-1),N、CIA組每日給予10 mL·kg~(-1)的蒸餾水,療程均為4周。膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型建立完成后,每周采用水容積法測(cè)量大鼠下肢容積;對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評(píng)分;經(jīng)HGW治療4周后光鏡下觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理形態(tài);TUNEL染色檢測(cè)大鼠滑膜細(xì)胞的凋亡。采用全自動(dòng)血流變儀檢測(cè)大鼠外周血中全血高切及低切粘度;ELISA法檢測(cè)大鼠外周血中CollagenII Ab抗體、IL-1β、IL-3、GM-CSF、IL-8、IL-11、IFN-r、RF、CRP等細(xì)胞因子的含量;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中IL-2、IL-4、IL-10、IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的含量;免疫組化法檢測(cè)大鼠滑膜組織中VEGF、Bcl-2、BAX、SOCS1、SOCS3、STAT1、STAT3、JAK3的蛋白表達(dá)水平;采用Western blot技術(shù)分別從基因和蛋白的角度來觀察STAT3、JAK3及其負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子SOCS1、SOCS3的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果N組大鼠毛色白亮、光澤度好,進(jìn)食可,四肢活動(dòng)自由,反應(yīng)靈敏,足爪未見腫脹,體重增長(zhǎng)快且平穩(wěn);CIA組大鼠毛發(fā)暗淡無(wú)光澤,進(jìn)食明顯減少,雙后足腫脹潰爛伴跛行,時(shí)有哀鳴、喜扎堆,弓背蜷縮,攝食量降低,大便質(zhì)稀,反應(yīng)遲鈍,體重增加不明顯;各用藥組大鼠毛色光澤度及進(jìn)食較前改善,雙后足腫脹度及跛行減輕,活動(dòng)量增加,體重增長(zhǎng)平穩(wěn)。造模完成后,大鼠雙足足跖及踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱等急性免疫反應(yīng);第2周,與N組比較,CIA組大鼠足趾腫脹度極顯著升高(P0.01);第2周和第6周,與N組相比,CIA組大鼠關(guān)節(jié)炎癥積分極顯著差異(P0.01)。第2周,與CIA組相比,TFN組和HGW-L、M、H組大鼠關(guān)節(jié)炎癥積分未見明顯差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);第6周,與CIA組相比,TFN組和HGW-M、H組大鼠關(guān)節(jié)炎癥積分差異顯著(P0.05,P0.01)。與N組相比,CIA組大鼠血清RF、CRP、CollagenII抗體含量有極顯著差異(P0.01)。在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):N組大鼠滑膜細(xì)胞排列規(guī)則無(wú)增生,血管散在分布,關(guān)節(jié)腔內(nèi)未見滲出物,關(guān)節(jié)表面光滑。CIA組大鼠滑膜細(xì)胞大量增生、血管翳形成,可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),關(guān)節(jié)面粗糙,關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重。TFN組和HGW-L、M、H用藥組干預(yù)后不同程度抑制了滑膜組織的增生,單核及淋巴細(xì)胞有不同程度的減少。與N組比較,CIA組大鼠STAT3、SOCS1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05,P0.01);與CIA組比較,HGW-H組大鼠STAT3、JAK3、SOCS1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05);與CIA組比較,TFN組大鼠JAK3蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。與N組相比較,CIA組大鼠滑膜細(xì)胞增多,凋亡率顯著下降(P0.05);與CIA組比較,HGW-H組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。與N組比較,CIA組大鼠在30/s、1/s切變率下的全血粘度和200/s切變率下的血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著升高(P0.01);與CIA組比較,HGW-H組、TFN組大鼠IL-4、IL-10的含量顯著升高(P0.05,P0.01);與N組比較,CIA組大鼠IL-1β的含量顯著升高(P0.05),IL-3、GM-CSF含量顯著降低(P0.05)。結(jié)論(1)黃芪桂枝五物湯對(duì)CIA模型大鼠足趾的關(guān)節(jié)炎癥有明顯的治療作用,其機(jī)制可能是HGW通過調(diào)節(jié)了CIA大鼠外周血中炎細(xì)胞因子IL-2、IL-1、IL-6、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN-r、RF、CRP、CollagenII的分泌,對(duì)減少軟骨細(xì)胞的損傷和凋亡,減輕軟骨和滑膜的損傷,保護(hù)關(guān)節(jié)起到抗炎,調(diào)節(jié)免疫的作用。(2)黃芪桂枝五物湯能夠促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡,可能是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一。(3)黃芪桂枝五物湯通過對(duì)JAK3/STAT3信號(hào)通路蛋白的抑制作用而起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)。
【學(xué)位單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

表 4 HGW 對(duì) CIA 模型大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響（x±s，n=12）分組 第 1 周 第 2 周 第 3 周 第 4 周 第 5 周 第 6 周N 10.79±3.12 11.85±2.87 19.50±3.80 24.57±4.95 29.38±6.82 30.28±6CIA 62.88±6.21*64.96±7.28*87.43±6.44*87.50±5.65*87.22±8.72*87.43±8HGW-L 61.11±8.05 66.21±7.04 85.22±6.91 81.03±6.12 79.20±7.15 71.97±6HGW-M 59.49±6.21 62.51±8.09 83.70±5.28 77.28±6.85▲69.12±5.16▲62.13±6HGW-H 58.31±4.32 63.26±6.12 79.32±5.55▲72.98±8.67▲63.48±5.92▲54.38±8TFN 58.78±2.39 63.80±6.82 73.42±5.78▲72.95±6.59▲64.98±8.15▲58.32±4注：與 N 組相比，*P㩳0.05；與 CIA 組相比，▲P㩳0.05；

TFN 組和 HGW-M、H 組大鼠關(guān)節(jié)炎癥積分差異顯著（P＜0.05，P＜0 5，圖 3）。表 5 HGW 對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（x ±s，n=12）組別劑量/ g·m L-1第 2 周 第 6 周N - 0.00±0.00 0.00±0.00CIA - 9.85±0.96**10.35±0.95**TFN 15 ×10-39.71±1.32 6.74±0.76▲▲HGW-L 16 9.56±0.83 9.02±0.84HGW-M 32 9.84±1.35 8.95±0.83▲HGW-H 64 9.68±0.91 7.83±0.71▲▲注：與 N 組相比，**P㩳0.01；與 CIA 組相比，▲P㩳0.05，▲▲P㩳0.01；

5 黃芪桂枝五物湯對(duì) JAK3/STAT3 信號(hào)通路蛋白的影響 免疫組化檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜 JAK3、STAT3、SOCS1 的結(jié)果：與 N 組比較組大鼠 STAT3、JAK3、SOCS1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）IA 組比較，HGW-H 組大鼠 STAT3、JAK3、SOCS1 蛋白表達(dá)水平顯著降低5）；與 CIA 組比較，TFN 組大鼠 JAK3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）（ 5、8、9、10）。 免疫組化檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜 STAT1、VEGF、SOCS3 的結(jié)果：與 N 組比較組大鼠 STAT1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與 N 組比較，D E FA:N 組 B:CIA 組 C:HGW-L 組 D:HGW-M 組 E:HGW-H 組 F:TFN 組圖 4 HGW 對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理的影響（HE,×200）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2815781