1 研究背景肝郁脾虛證是常見的中醫(yī)證候,常見于抑郁、焦慮、胃炎、腸易激綜合征等肝膽系疾病、消化系統(tǒng)疾病和腸道疾病,臨床涉及40多個疾病病種。逍遙散是治療肝郁脾虛證的經(jīng)典方劑。目前關(guān)于肝郁脾虛證的生物學基礎尚不完全清楚,因此逍遙散治療該證候的治療機制亦不完全清楚。慢性應激可引發(fā)焦慮癥、抑郁癥等多種疾病。基于慢性應激具有過程性和階段性的特點,與肝郁脾虛證形成的病因具有高度的一致性和相關(guān)性,經(jīng)相關(guān)研究證實可以用于肝郁脾虛證動物模型的造模�；谝陨显蚝捅緢F隊的前期工作基礎,本實驗采用慢性束縛應激的方法復制肝郁脾虛證大鼠模型,研究肝郁脾虛證的分子生物學基礎。前期研究證實肝郁脾虛證患者體內(nèi)存在多系統(tǒng)的功能紊亂,包括神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺/性腺/甲狀腺軸等方面。研究發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證患者和肝郁脾虛證動物模型均存在明顯的攝食量異常、體重增長速度改變、便溏或是便秘、消瘦或肥胖等現(xiàn)象。研究表明慢性束縛應激可通過腦-腸軸影響胃的吸收功能和腸道菌群變化。Insulin/PI3K/Akt信號通路是胰島素調(diào)節(jié)能量代謝的經(jīng)典通路。PI3K/Akt的下游靶蛋白較多,涉及細胞的生長、凋亡及腫瘤代謝甚至神經(jīng)信號傳導等多個方面;GLUJTs是PI3K/Akt信號通路介導糖脂代謝的下游分子;SHIP2是經(jīng)典PI3K/Akt信號通路的抑制劑,因此,上述物質(zhì)均是參與了能量代謝尤其是糖脂代謝的調(diào)節(jié)機制。肝郁脾虛患者常伴有明顯的食欲異常、消瘦或肥胖等能量代謝異�，F(xiàn)象,因此本實驗采用慢性應激的方法復制肝郁脾虛證大鼠模型,以Insulin/PI3K/Akt/GLUTs和SHIP2信號通路為切入點,探討肝郁脾虛證能量代謝異常的生物學基礎及逍遙散的治療機制。2實驗目的(1)觀察肝郁脾虛證大鼠肝臟胰島素PI3K/Akt/GLUT2信號通路相關(guān)蛋白和SHIP2蛋白的表達變化,以期探討肝郁脾虛證能量代謝異常的分子生物學基礎。(2)探索逍遙散治療肝郁脾虛證的生物學機制,為中醫(yī)肝郁脾虛證及中醫(yī)臨床防治慢性應激類疾病提供實驗依據(jù)。3實驗方法本實驗主要由四部分組成。實驗第一部分:通過21天慢性束縛應激法復制肝郁脾虛證大鼠模型,逍遙散作為治療藥物,以氟西汀和羅格列酮為陽性對照;分別從動物宏觀表征,飲食、體重變化,曠場試驗,強迫游泳實驗,糖水偏好實驗,胃腸動力學實驗,排便情況,皮質(zhì)酮水平及佐證逍遙散的治療效果,共同證實所造模型為肝郁脾虛證動物模型。實驗第二部分:采用酶免疫分析法和免疫放射法測定外周血中胰島素和血脂四項的含量,探索能量代謝異常與糖脂代謝的關(guān)系。實驗三部分:證實糖脂代謝異常的基礎上,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法研究大鼠肝臟P85、Akt和SHIP2 mRNA的表達變化。實驗第四部分:采用免疫印跡法和免疫組化法分別半定量和定量檢測大鼠肝臟P85、Akt、GLUT2和SHIP2蛋白的表達變化;并觀察逍遙散組大鼠肝臟相關(guān)物質(zhì)基因和蛋白的表達水平,分析其治療肝郁脾虛證模型能量代謝異常和逍遙散干預的分子生物學機制。4實驗結(jié)果(1)實驗一顯示慢性束縛應激導致逐漸出現(xiàn)攝食量減低、體重增加速度減緩,毛發(fā)枯黃、懶怠少動、大便干濕不調(diào)等外觀體征狀態(tài)變化;行為學研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在曠場實驗中的穿格次數(shù)和移動總距離明顯增加,糖水偏好率降低,強迫游泳時水中停浮時間明顯延長,胃排空能力和小腸推進率較證明組明顯下降、排便量增多或減少、便溏或是便秘等分化現(xiàn)象明顯;血清中皮質(zhì)酮含量明顯升高。而逍遙散、氟西汀和羅格列酮干預后上述現(xiàn)象和指標明顯出現(xiàn)不同程度的改善。(2)實驗二的結(jié)果表明,模型組大鼠外周胰島素和甘油三酯水平比正常組明顯降低,高、低密度脂蛋白和膽固醇含量無統(tǒng)計學差異。逍遙散、氟西汀和羅格列酮對外周血中胰島素和甘油三酯的表達水平均有調(diào)節(jié)作用,但與模型組比較并無統(tǒng)計學差異。(3)實驗三的研究結(jié)果顯示肝郁脾虛模型大鼠肝臟中P85、Akt蛋白的mRNA表達量降低,SHIP2 mRNA表達升高。與模型組相比,逍遙散干預后P85和Akt mRNA的表達量均有顯著升高,但SHIP2 mRNA的表達并無統(tǒng)計學差異;氟西汀組SHIP2 mRNA的表達明顯降低,P85和Akt mRNA表達高于模型組但低于逍遙散組;羅格列酮組P85、Akt和SHIP2 mRNA的表達均明顯升高。(4)實驗四研究發(fā)現(xiàn)與正常組比較,模型組大鼠肝臟P85蛋白含量較高、Akt和GLUT2蛋白含量明顯降低,SHIP2含量較高。與模型組相比,逍遙散組P85的含量較低,Akt和GLUT2蛋白含量升高,但SHIP2蛋白含量與模型組比較并無統(tǒng)計學差異;氟西汀干預后SHIP2蛋白含量明顯降低,GLUT2蛋白含量升高,但Akt和GLUT2蛋白含量無統(tǒng)計學差異;羅格列酮組大鼠肝臟中P85、Akt、GLUT2和SHIP2蛋白含量均高于模型組。5結(jié)論(1)結(jié)合對大鼠的觀察、行為學實驗結(jié)果及血清CORT的含量,證明本次實驗應用慢性束縛應激的方法成功的復制了肝郁脾虛證大鼠模型。此外,實驗發(fā)現(xiàn)逍遙散和氟西汀在大鼠情志異常方面均有調(diào)節(jié)作用,但氟西汀的作用功效優(yōu)于逍遙散,羅格列酮在情志調(diào)節(jié)方面并未顯示出顯著變化;三組藥物對肝郁脾虛證大鼠的攝食、體重及胃腸功能等方面均有影響價值,但羅格列酮的作用功效優(yōu)于逍遙散,逍遙散的作用效果優(yōu)于氟西汀。(2)模型組大鼠外周血中胰島素和血脂中TG含量降低,說明肝郁脾虛證大鼠的食欲降低、體重增長速度緩慢、胃腸功能紊亂等情況與體內(nèi)的能量代謝機制異常相關(guān)。(3)實驗三和實驗四的研究結(jié)果結(jié)合表明肝郁脾虛證的能量代謝異常機制與Insulin/PI3K/Akt/GLUT2信號通路的低表達和SHIP2的抑制有關(guān);逍遙散能明顯促進肝郁脾虛證模型大鼠Insulin/PI3K/Akt/GLUT2信號通路的表達,但對該信號通路的抑制因子(SHIP2)的表達并無調(diào)節(jié)作用;氟西汀可調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達水平,但其下游靶點因子并非GLUT2,且氟西汀對SHIP2蛋白的表達并無介導作用;羅格列酮可通過增加胰島素和PI3K/Akt信號通路的敏感性增加Insulin/P13K/Akt/GLUT2信號通路的表達,由于該組大鼠肝臟SHIP2蛋白的表達并無顯著降低,說明羅格列銅對肝郁脾虛證并無治療效果。(4)本次研究說明逍遙對肝郁脾虛證模型大鼠的情志變化和能量代謝異常均有明顯的治療效果,氟西汀對大鼠的情志異常有顯著的調(diào)節(jié)作用,但其對能量代謝的調(diào)節(jié)作用低于逍遙散,且兩種藥物對能量代謝的干預機制并非完全一致,羅格列酮可通過其對胰島素及PI3K/Akt信號通路的增敏作用影響能量代謝,但肝郁脾虛證的情志低落等情況并無治療功效。此次研究可為今后肝郁脾虛證的能量代謝機制及逍遙散的治療機制提供依據(jù)。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

活動量仍然較少，但肥胖明顯。逡逑組大鼠受每周的糖水實驗禁食的影響毛發(fā)光澤略暗，但與其他四組大鼠態(tài)良好。逡逑大鼠進食量及體重變化逡逑食量變化逡逑采用重復測量的方差分析法對慢性束縛應激期間各組大鼠每日的攝食均統(tǒng)計。多變量檢測結(jié)果顯示組間比較存在顯著差異（尸＜0．0１），但隨時間食量自身并無明顯差異（尸＝０．８４２）。Ｍａｎｕｃｈｌｙ球形度檢驗顯示Ｆ＝２，進食差矩陣球形性檢驗（Ｐ＝０．１８７）。成對比較結(jié)果顯示各組大鼠的每日平均攝顯著差異（Ｐ＞0．0５）；多組比較結(jié)果顯示正常組比模型組大鼠每日的平均高，羅格列酮干預后大鼠的每日平均攝食量顯著升高（尸＜0．0５）。逡逑３４．００－逡逑

注：與正常組比較，＊＊＊尸＜0．0１；與模型組比較，＿Ｐ＜０．０１逡逑３．２．２體重變化逡逑重復測量的方差分析法用于分析各組大鼠每周體重的變化趨勢，結(jié)果如圖１－２所示。逡逑多變量檢測結(jié)果顯不存在顯著差異（Ｐ＜０．０１）。Ｍａｎｕｃｈｌｙ球形度檢驗顯示Ｆ＝２２９１．８９８，進逡逑食量數(shù)據(jù)不滿足協(xié)方差矩陣球形性檢驗0Ｐ＜0．0１），Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ－Ｇｅｉｓｓｅｒ法校正后組內(nèi)因素逡逑（造模天數(shù)）和組間因素對大鼠的進食量的影響具有顯著意義（尸＝０．０００），且具有交互效應逡逑（Ｐ＝０．０００）。說明實驗大鼠的體重隨時間變化顯著，造模及藥物干預后大鼠體重出現(xiàn)明顯逡逑變化，造模方法、藥物與時間有交互效應。逡逑３６０邋－逡逑■邋＇邋？逡逑％邋３３３邋一ｒＳＣｉｉ逡逑２２０邐時叵（ｄ）逡逑０邐７邐１４邐２１逡逑圖１－２大鼠體重均數(shù)變化趨勢圖逡逑６４逡逑

逡逑如圖１－２顯示，慢性應激干預后模型組大鼠在三周內(nèi)的體重增長速度分別明顯低于逡逑對應時間內(nèi)正常組大鼠的體重增長速度。第一周內(nèi)，逍遙散干預后大鼠的體重增長速度逡逑低于正常組，但與模型組間無明顯差異；氟西汀組體重增長速度低于正常組，但明顯高逡逑于模型組；羅格列酮組大鼠體重增長速度與正常組無顯著差異。束縛應激第二周時，逍逡逑遙散組大鼠的體重增長速度開始高于模型組；氟西汀和羅格列酮干預后大鼠體重增長速逡逑度顯著高于模型組。實驗進行第三周時，逍遙散和氟西汀組大鼠體重增加明顯高于模型逡逑組，但逍遙散組大鼠的體重增長速率高于氟西汀組；羅格列酮組大鼠體重明顯高于模型逡逑組，但體重增長速度低于正常組。逡逑３．３各組大鼠行為學比較逡逑３．３．１曠場實驗逡逑Ａ邐Ｂ邐？逡逑２００－１邐８０－Ｉ邐＾逡逑Ｉ１５０＇邐Ｔ逡逑Ｉ１。。＿邐ｆ邋Ｈ邋５邐１２。。。－＿邋■邋■邐■逡逑＾0ｌｔ；ｉ邋．邐，邋ｉ邋，邋0�。叔澹殄澹咤义蠄D１－３各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較逡逑注：與正常組比較

【參考文獻】

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本文編號：2815695