發(fā)布時間：2020-09-09 10:03

　　 目的:采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(液質(zhì)聯(lián)用)檢測開心散中主要有效成分,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供質(zhì)量保證。觀察開心散低、中、高劑量對東莨菪堿致認(rèn)知障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響,探討開心散改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制,為認(rèn)知障礙的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:實(shí)驗(yàn)一:開心散有效組分的質(zhì)量控制將開心散的人參、茯苓、石菖蒲、遠(yuǎn)志四味中藥按照3:3:2:2比例投料,采用加熱回流提取法進(jìn)行萃取,分別收取石菖蒲揮發(fā)油及人參提取液;將石菖蒲藥渣、人參藥渣與茯苓、遠(yuǎn)志共煎后合并藥液。減壓濃縮后按比例將石菖蒲揮發(fā)油與提取原液混勻,檢測前采用固相萃取進(jìn)行預(yù)處理。將人參皂苷Rg1、遠(yuǎn)志皂苷元、遠(yuǎn)志山酮III、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇配置成濃度為50μM/L待測溶液。最后采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對開心散進(jìn)行有效成分檢測。實(shí)驗(yàn)二:開心散對認(rèn)知障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及機(jī)制研究1.行為學(xué)實(shí)驗(yàn):8周齡健康SPF級雄性昆明小鼠72只,隨機(jī)分為:正常組、模型組、開心散低劑量組、開心散中劑量組、開心散高劑量組、陽性藥對照組。除正常組和模型組予0.9%生理鹽水外,開心散組分別以0.7 g/kg/d、1.4 g/kg/d、2.8 g/kg/d給藥,陽性藥對照組給予3 mg/kg/d的多奈哌齊,治療周期為14天,每日一次。給藥后第8日開始行為學(xué)測試,測試前1小時灌胃給藥,測試前半小時造模干預(yù),除正常組用0.9%生理鹽水代替外,其余各組小鼠予以東莨菪堿3 mg/kg/d腹腔注射。2.生化指標(biāo)檢測:采用尼氏染色觀察小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元損傷狀況;TUNEL染色觀察小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡狀況;采用Western Blot法觀察小鼠腦海馬和皮質(zhì)中Bcl-2、Bax、PSD95、SYN、BDNF蛋白的表達(dá)變化;采用試劑盒檢測法對小鼠腦海馬和皮質(zhì)中Ach、ChAT、AChE、SOD、GSH-Px、ROS、MDA的活性及含量進(jìn)行檢測。結(jié)果:1.開心散有效組分的質(zhì)量控制通過液質(zhì)聯(lián)用及其二級質(zhì)譜碎片結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品可指認(rèn)的包括5個有效成分,分別是遠(yuǎn)志皂苷元、遠(yuǎn)志山酮III、人參皂苷Rg1,β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚。2.開心散對認(rèn)知障礙模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的作用(1)Morris水迷宮定位航行結(jié)果提示:模型組小鼠逃避潛伏期較正常組小鼠顯著延長(P0.01),開心散的低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組均可縮短模型小鼠的逃避潛伏期(P0.01)。游泳軌跡顯示:與正常組和給藥組相比,模型組小鼠表現(xiàn)出雜亂無序的游泳軌跡�？臻g探索結(jié)果提示:模型組小鼠在穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間較正常組顯著減少(P0.01),開心散的低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組均可改善上述指標(biāo)(P0.01);在游泳速度方面,模型組小鼠明顯慢于正常組(P0.05),而給藥組與模型組之間的差異無顯著性(P0.05)。(2)Y迷宮結(jié)果提示:模型組小鼠在三個臂中的交替百分比較正常組明顯減少(P0.01),開心散中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊均可提高模型小鼠在三個臂中的交替百分比(P0.05)。3.開心散對認(rèn)知障礙模型小鼠生化指標(biāo)的影響(1)尼氏染色結(jié)果提示:和正常組相比,模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少,細(xì)胞內(nèi)尼氏小體減少甚至消失,呈空泡泡樣,排列紊亂,開心散低、中、高劑量組及陽性藥多奈哌齊可減輕神經(jīng)元損傷,改善神經(jīng)細(xì)胞存活狀況。(2)TUNEL染色結(jié)果提示:和正常組相比,模型組小鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)目減少,凋亡小體顯著增加,部分神經(jīng)元形態(tài)異常,開心散低、中、高劑量及陽性藥多奈哌齊可減輕神經(jīng)元凋亡狀況。(3)Western Blot結(jié)果提示:與正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)Bax/Bcl-2比值顯著增加(P0.05或P0.01),開心散低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組可下調(diào)Bax/Bcl-2比值(P0.05或P0.01)。與正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)PSD95、SYN、BDNF的表達(dá)水平顯著下降(P0.05或P0.01),開心散低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組可不同程度上調(diào)PSD95、SYN、BDNF的表達(dá)(P0.05或P0.01)。(4)試劑盒檢測結(jié)果提示:和正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)AchE的活性明顯增加(P0.05或P0.01),ChAT的活性明顯下降(P0.05),Ach的水平明顯減少(P0.05或P0.01),開心散的低、中、高劑量組和陽性藥組可不同程度調(diào)節(jié)上述指標(biāo)(P0.05或P0.01)。和正常組相比,模型組小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)SOD(P0.05)、GSH-Px(P0.05或P0.01)明顯下降,MDA(P0.05或P0.01)和ROS(P0.01)水平明顯升高,開心散的低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組明顯增加SOD、GSH-Px(P0.05或P0.01)的活性,降低MDA和ROS(P0.05或P0.01)的水平。結(jié)論:1.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測出開心散中含5種主要有效成分,為進(jìn)一步探討開心散改善認(rèn)知障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能奠定了藥效學(xué)基礎(chǔ)。2.開心散低、中、高劑量可改善認(rèn)知障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能,其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是通過減輕神經(jīng)元損傷,抗細(xì)胞凋亡,改善突觸功能,調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì),提高抗氧化應(yīng)激能力而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5;R-332
【部分圖文】：

液質(zhì)聯(lián)用色譜圖

Morris水迷宮入水點(diǎn)示意圖

開心散對認(rèn)知障礙模型小鼠定位航行測試逃避潛伏期的影響

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2814829