發(fā)布時間：2020-09-09 08:35

　　 懷山藥是著名的四大懷藥之一,多糖為懷山藥的重要活性成分,具有諸多藥理方面的作用,現(xiàn)已成為懷山藥化學成分與功能性成分的研究熱點。然而,目前關于懷山藥多糖抗衰老的研究大多只集中于生物學活性的檢測上,對其作用的分子機理方面相關研究,特別是懷山藥多糖對抗衰老基因的表達調控研究還沒有引起足夠的重視。本研究以懷山藥為研究對象,采用水提醇沉法分離和純化多糖,通過體內(nèi)和體外的抗衰老實驗,系統(tǒng)地研究懷山藥多糖在抗衰老方面的活性及其對抗衰老基因Klotho的表達調控作用,為闡明懷山藥的抗衰延壽作用提供科學依據(jù)。本文的主要研究內(nèi)容包括以下四個部分:1.懷山藥多糖的提取和分離:采用水提醇沉法提取懷山藥多糖,Sevage法去除蛋白,透析法純化,又用SDS-PAGE、Molish反應及紅外光譜法進行鑒定,結果表明提取物為懷山藥多糖,苯酚-硫酸法測定其多糖含量為91.77%。2.懷山藥多糖的體外抗衰老活性:采用CCK-8法和β-半乳糖苷酶染色法檢測懷山藥多糖對NRK-52E細胞和TCMK-1細胞的影響,結果表明懷山藥多糖對兩種正常細胞無抑制作用;而對于H_2O_2所造成的細胞氧化應激損傷具有明顯的保護作用,說明懷山藥多糖具有顯著的抗衰老活性。3.懷山藥多糖的體內(nèi)抗衰老活性:采用D-半乳糖誘導小鼠建立衰老動物模型,口服給予不同劑量的懷山藥多糖,考察懷山藥多糖的體內(nèi)抗衰老活性,結果表明,懷山藥多糖能明顯改善小鼠的學習記憶能力和空間識別能力,且存在明顯的量-效關系,同時海馬組織病理切片顯示,懷山藥多糖能明顯改善衰老小鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞的退化、變形現(xiàn)象,修復衰老小鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞的損傷。此外,懷山藥多糖亦能明顯改善衰老小鼠肝、腎組織器官的病理狀態(tài),使肝、腎的儲備能力得到修復,從而改善衰老小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)的生理指標,具有明顯的抗衰老活性。4.懷山藥多糖對Klotho基因的表達調控研究:提取小鼠腦、腎組織中的總RNA,并反轉錄成cDNA;然后采用PCR及實時熒光定量PCR法檢測小鼠腦、腎臟組織中抗衰老基因Klotho的表達水平,結果表明懷山藥多糖能明顯增加小鼠腦、腎臟組織中Klotho基因的表達量進而起到抗衰老的作用。綜合上述結果表明,懷山藥多糖具有明顯的抗衰老活性,是一種值得深入研究的新型藥物和功能性食品,其抗衰老的機制可能是通過清除體內(nèi)自由基,有效改善機體的生理狀態(tài),使各組織器官的功能得到修復。在此基礎上,通過調節(jié)體內(nèi)抗衰老基因Klotho的表達水平來共同實現(xiàn)其抗衰老作用,這一結果更進一步為中醫(yī)認為的“腎虛致衰學說”和西醫(yī)認為的“遺傳程序學說”提供了實驗基礎和科學依據(jù)。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285;R284
【部分圖文】：

1.1.1 衰老及其現(xiàn)狀長期以來衰老都是一個備受關注的話題，不同領域包括醫(yī)藥及美容行業(yè)都有著與之密不可分的聯(lián)系。衰老的特征在于機體的生理功能逐漸減弱，各個器官受損并最終導致機體死亡。同時隨著衰老的發(fā)生，機體也會產(chǎn)生諸多病變，包括癌癥、糖尿病、心血管相關疾病和神經(jīng)退行性疾病等[1]。人類的老齡化與預計的壽命之間呈現(xiàn)出正相關的關系，而人口老齡化則意味著老年人口數(shù)量的增加、老年人口比例以及老年疾病比例的上升，因此人口老齡化為衰老科學提出了更高更緊迫的要求及任務[2]。據(jù)統(tǒng)計，我國的老年人口所占比例由 1980 年的 3%增長到 2010 年的 13%[3]。根據(jù) 2019 年 2 月國家統(tǒng)計局發(fā)布的《2018 年國民經(jīng)濟和社會發(fā)展統(tǒng)計公報》，如表 1.1 所示，我國的總人口為 13.95 億，其中 60 歲以上人口已達 17.9%，65 歲以上人口也已經(jīng)高達 11.9%。顯然，老年人口所占的比例呈逐年上升的趨勢。據(jù)專家預測，到 2050 年，老齡化人口數(shù)目將達至我國總人口的 20%左右，可見老年人口占據(jù)比例更加巨大，人口老齡化形勢更加嚴峻，因而也會引發(fā)更多的社會問題[3-5]。

圖 1.2 “抗衰老”的學科分布中醫(yī)理論與衰老理論認為人從誕生至死亡，必然要經(jīng)歷出生、成長、強壯、生命階段，衰老是隨著年齡的增長，生命精華物質不斷虧損和形體生理結構逐漸衰退的現(xiàn)象[6]。古代書籍中不乏對于衰老帝內(nèi)經(jīng)太素 卷之三 陰陽》寫道“若人能修道察同，去損益之

準確稱取 5 mg 懷山藥多糖粉末，超純水定容至 50 mL。從中取 1 mL 溶液置于具塞試管中，按照以上方法測得樣品吸光度，通過得出的葡萄糖濃度標準曲線方程，計算懷山藥多糖的含量。2.4 結果與討論2.4.1 懷山藥多糖純化及鑒定結果通過分別對去除蛋白質前后的多糖進行 SDS-PAGE 電泳來檢測多糖中的蛋白是否被去除，結果如圖 2.1A 所示，未去除蛋白之前懷山藥中的蛋白質只有一種，其分子量為 35 kDa。而采用 Sevage 法去除蛋白質后的多糖，從圖 2.1A 第 3泳道可以看出蛋白條帶幾乎消失，表明懷山藥多糖中的蛋白質已經(jīng)被去除。圖2.1B 為去除蛋白質后紫外掃描全波長的結果圖，280 nm 為蛋白質在紫外下的最大特征吸收波長，從圖中可見該處沒有明顯的紫外吸收峰，此結果與侯宇等[55]報道的實驗結果類似，即說明懷山藥多糖中蛋白質已經(jīng)去除。圖 2.1C 為 Molish反應[56]結果，圖中可以分別看出懷山藥多糖和葡萄糖兩個試管中的兩個液面之間均有一紫色環(huán)，表明此方法提取的物質為多糖成分。

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本文編號：2814750