目的:利用氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型觀察野黃芩苷對(duì)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化及其伴隨的脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)和改善肝脂變的作用,并以氧化應(yīng)激為切入點(diǎn)深入探討相關(guān)作用機(jī)制。材料與方法:SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分成8組(n=8),空白對(duì)照組(Blank control)、模型組(H-S)、立普妥組(LIP5)、血府逐瘀湯組(XFZY20)、野黃芩苷高劑量組(SCU300)、野黃芩苷中劑量組(SCU100)、野黃芩苷低劑量組(SCU50)和NaHS組(NaHS)。動(dòng)物分組后空白對(duì)照組給予普通飼料12周,其余各組采用喂飼成年大鼠特殊飼料12周,維生素D3腹腔注射600000 IU/Kg 3天(第一天至第三天),同時(shí)給予大鼠施加慢性、不可預(yù)見(jiàn)的應(yīng)激性刺激(聲、光、電)的方式,持續(xù)時(shí)間為12周;實(shí)驗(yàn)第9周各藥物干預(yù)組開(kāi)始分別灌胃給予立普妥5mg/kg/d、血府逐瘀湯20g(以含生藥計(jì))/kg/d、野黃芩苷300 mg/kg/d、100 mg/kg/d、50 mg/kg/d,腹腔注射N(xiāo)aHS 2.8mg/kg/d,每日1次,每周測(cè)量大鼠體重并觀察大鼠的精神狀態(tài)、被毛和舌象,并給予評(píng)分。藥物連續(xù)干預(yù)4周后,禁食16h麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采血,分離血清或血漿,應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)ALT、AST、BUN、CREA、ALB、TP、LDL-C、HDL-C、CHOL、TG等生化指標(biāo),應(yīng)用Sysmex CA-1500型全自動(dòng)血凝分析儀檢測(cè)FIB、PT、APTT、TT,應(yīng)用血液粘度儀檢測(cè)全血粘度(高、中、低切粘度)和血漿粘度,應(yīng)用亞甲基分光光度法檢測(cè)血清中H_2S濃度;應(yīng)用英國(guó)moor激光多普勒血流儀,檢測(cè)大鼠尾部正中、心臟、肝臟、右腎臟組織血流量指標(biāo);分離肝臟、主動(dòng)脈、心臟、腎臟等組織,濾紙吸干水分。肝臟、腎臟及心臟稱(chēng)重,計(jì)算臟體指數(shù),切取一部分組織于-80℃冰箱保存,用于后面的實(shí)驗(yàn);其余放福爾馬林中固定,待組織病理學(xué)分析備用。利用HE染色觀察大鼠肝臟脂肪變性和胸主動(dòng)脈硬化病變情況以及各藥物干預(yù)情況;應(yīng)用TBA法檢測(cè)血清和肝組織MDA濃度,應(yīng)用羥胺法檢測(cè)血清和肝組織T-SOD活力,應(yīng)用分光光度法檢測(cè)血清和肝組織GSH含量;利用Western blot、免疫熒光及qPCR技術(shù)檢測(cè)野黃芩苷對(duì)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠肝組織和胸主動(dòng)脈中抗氧化應(yīng)激重要調(diào)控因子Nrf2及其下游NQO1、HO-1基因和蛋白表達(dá)的影響;進(jìn)一步利用Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)野黃芩苷對(duì)Nrf2因子上游PI3K/Akt信號(hào)通路中的PI3K P85和磷酸化Akt(Ser473)活性蛋白在肝組織和主動(dòng)脈中表達(dá)的影響;利用qPCR技術(shù)分別檢測(cè)肝組織和主動(dòng)脈中Akt基因的表達(dá)水平;利用Western blot及qPCR技術(shù)檢測(cè)野黃芩苷對(duì)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠肝組織和胸主動(dòng)脈中內(nèi)源性氣體分子H_2S的重要生成及調(diào)節(jié)基因CSE表達(dá)的影響。結(jié)果:1.野黃芩苷對(duì)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠脂代謝的調(diào)節(jié)及肝脂肪變性的保護(hù)作用。經(jīng)野黃芩苷干預(yù)4周,氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體重止降,且逐漸恢復(fù);實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),其可顯著降低肝重及肝體指數(shù)、腎體指數(shù)、心體指數(shù)(PO.O1),并對(duì)肝功能有一定的保護(hù)作用;野黃芩苷可顯著降低氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清中LDL-C、HDL-C、CHOL和AI指數(shù)(PO.O1),調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝,改善血脂水平;此外,野黃芩苷可顯著降低血清CREA,提示其在一定程度上可以保護(hù)腎功能。肝臟大體觀察表明,空白對(duì)照組大鼠肝臟形態(tài)大小正常,色澤紅潤(rùn),表面光滑,邊緣銳利;模型組大鼠肝臟呈黃褐色,邊緣鈍而厚,表面粗糙,油膩感,部分肝臟表面可見(jiàn)黃色小結(jié)節(jié),提示大鼠肝臟脂肪變性嚴(yán)重;給予野黃芩苷后大鼠肝臟較模型組有所改善,顏色偏紅褐色,表面光滑。組織病理學(xué)檢查表明,模型組可見(jiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞甚至炎細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞腫脹,呈氣球樣變,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量脂肪空泡,核被擠于細(xì)胞邊緣;經(jīng)野黃芩苷干預(yù)4周后,肝組織結(jié)構(gòu)較正常,偶爾可見(jiàn)肝索排列,肝細(xì)胞氣球樣變程度減輕,胞質(zhì)內(nèi)大泡性脂滴明顯減少,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯改善,可見(jiàn)散在肝細(xì)胞脂肪變性,以小空泡脂肪變?yōu)橹�。結(jié)果表明,野黃芩苷可以減輕氣滯血瘀型AS大鼠的肝脂肪變和脂代謝紊亂。2.野黃芩苷對(duì)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血瘀狀態(tài)的調(diào)節(jié)及胸主動(dòng)脈硬化的影響。經(jīng)野黃芩苷干預(yù)4周,氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠精神狀態(tài)、被毛、舌象等明顯改善(PO.O5),血流變學(xué)指標(biāo)全血粘度中、高切及血漿粘度呈顯著降低(PO.O5),凝血因子APTT明顯延長(zhǎng)(PO.O5),大鼠尾、心、肝、腎組織血流量得到明顯改善(PO.O1),結(jié)果表明,野黃芩苷可以改善氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的氣滯血瘀狀態(tài),其作用效果與活血化瘀典方藥物血府逐瘀湯相當(dāng)。組織病理學(xué)檢查大鼠胸主動(dòng)脈病變情況,空白對(duì)照組動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)明顯病變(0級(jí))。氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠可見(jiàn)動(dòng)脈內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積,斑塊內(nèi)見(jiàn)壞死組織及鈣化,動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞可見(jiàn)明顯鈣化(Ⅳ級(jí)、Ⅴ級(jí)、Ⅶ級(jí))。經(jīng)野黃芩苷干預(yù)4周病變程度后較模型組明顯改善,低劑量組大鼠動(dòng)脈管壁增厚,平滑肌細(xì)胞增生,內(nèi)皮下局灶性脂質(zhì)沉積、纖維組織增生,形成斑塊,中層平滑肌細(xì)胞增生、可見(jiàn)鈣化(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ級(jí));中劑量組大鼠動(dòng)脈管壁增厚,中層平滑肌細(xì)胞增生及零星鈣化,內(nèi)皮下局灶性脂質(zhì)沉積、纖維組織增生,形成斑塊較低劑量組略小(Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ級(jí));高劑量組動(dòng)脈管壁增厚,中層平滑肌細(xì)胞增生,內(nèi)皮表面不光滑,但未見(jiàn)脂質(zhì)沉積(Ⅴ級(jí))。由此可見(jiàn),野黃芩苷可以減輕氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈的硬化程度,抑制斑塊的形成。3.野黃芩苷對(duì)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的抗氧化應(yīng)激作用及其可能的機(jī)制研究。野黃芩苷干預(yù)4周后,氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清GSH含量顯著上升(PO.O5),血清SOD活力也有升高趨勢(shì);進(jìn)一步檢測(cè)肝組織中各氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化情況,發(fā)現(xiàn)野黃芩苷各劑量組MDA水平明顯降低(PO.O1),SOD活力及GSH含量顯著升高(PO.O1),結(jié)果提示,野黃芩苷可以調(diào)節(jié)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的MDA、SOD、GSH水平,從而發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的作用。Western blot和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,肝組織中的p-Nrf2蛋白表達(dá)水平在野黃芩苷干預(yù)4周后呈現(xiàn)明顯上升(PO.O1),并其下游抗氧化酶NQO1和HO-1也伴隨著呈顯著高表達(dá)(PO.O1),這一結(jié)果在應(yīng)用Western blot檢測(cè)胸主動(dòng)脈p-Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)中也得到了確證;在基因水平檢測(cè)中,肝和胸主動(dòng)脈Nrf2 mRNA及其下游NQO1mRNA的表達(dá)趨勢(shì)與蛋白表達(dá)基本相同;進(jìn)一步提示,野黃芩苷發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的機(jī)制可能是激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,上調(diào)其下游NQO1和HO-1,釋放SOD、GSH等抗氧化物質(zhì)。進(jìn)一步研究Nrf2因子的上游調(diào)控信號(hào)通路PI3K/Akt,發(fā)現(xiàn)野黃芩苷可以顯著增加肝組織和胸主動(dòng)脈中PI3K P85和磷酸化Akt(Ser473)蛋白表達(dá)水平(PO.O1),免疫熒光檢查進(jìn)一步顯示PI3K P85在肝組織中呈高表達(dá)(PO.O1);在基因水平檢測(cè)中,野黃芩苷可以明顯上調(diào)在肝組織和胸主動(dòng)脈中AKT mRNA基因表達(dá),這與蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致;同時(shí),p-AKT活化蛋白與p-Nrf2表達(dá)具有相關(guān)性,前者可以促進(jìn)后者核轉(zhuǎn)位,調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)與ARE的結(jié)合。上述結(jié)果提示,野黃芩苷也可能激活PI3K/Akt信號(hào)通路,通過(guò)激活的p-Akt來(lái)活化Nrf2,實(shí)現(xiàn)其抗氧化應(yīng)激,保護(hù)細(xì)胞作用。4.野黃芩苷對(duì)氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠內(nèi)源性氣體分子信號(hào)通路H_2S/CSE的影響。氣滯血瘀型AS大鼠血清中H_2S濃度呈明顯升高,野黃芩苷干預(yù)4周后,其血清中H_2S濃度顯著下降(PO.O1);同時(shí),野黃芩苷可以下調(diào)體內(nèi)H_2S重要生成及調(diào)節(jié)因子CSE的蛋白表達(dá)水平,但其肝中基因水平呈明顯高表達(dá)(PO.O1),主動(dòng)脈CSE mRNA卻未見(jiàn)明顯的影響。該結(jié)果提示,野黃芩苷可能與內(nèi)源性氣體分子H_2S有關(guān),其可以作用于肝組織內(nèi)源性氣體分子H_2S/CSE信號(hào)通路,在一定程度上調(diào)節(jié)H_2S的釋放,但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。結(jié)論:1、野黃芩苷可以通過(guò)活血化瘀、降血脂及抗氧化應(yīng)激,三方面綜合作用實(shí)現(xiàn)抗氣滯血瘀型動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)野黃芩苷對(duì)肝腎損傷的影響,這一點(diǎn)優(yōu)于臨床常用降脂藥立普妥。2、本研究重點(diǎn)以氧化應(yīng)激為著眼點(diǎn),探討野黃芩苷抗氣滯血瘀型AS可能的作用機(jī)制:(1)直接激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,啟動(dòng)ARE調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,激活NQO1、HO-1蛋白表達(dá),增強(qiáng)SOD活力、提高GSH含量,減少M(fèi)DA水平等,實(shí)現(xiàn)抗氧化應(yīng)激作用。(2)通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路,上調(diào)PI3K,Akt磷酸化并激活,從而活化下游Nrf2因子,激活體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激重要通路Nrf2/ARE信號(hào)通路。3、氣滯血瘀型AS與內(nèi)源性氣體信號(hào)分子H_2S間存在聯(lián)系,其內(nèi)在機(jī)理還需深入研究;野黃芩苷作用于肝組織內(nèi)源性氣體分子H_2S/CSE信號(hào)通路,調(diào)控其對(duì)血管的調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R285.5
【部分圖文】：

各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間每周觀察精神狀態(tài)評(píng)分情況（x±SE）

各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間每周觀察被毛評(píng)分情況（x±SE）

圖 1.3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間每周觀察舌象評(píng)分情況（ x±SE）2.野黃芩苷對(duì)大鼠體重、臟器重量及臟器指數(shù)的影響如圖 2.1 大鼠體重動(dòng)態(tài)圖所示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中空白對(duì)照組大鼠呈現(xiàn)穩(wěn)步上升；而經(jīng)特殊飼料喂養(yǎng)和應(yīng)激性刺激聯(lián)合誘導(dǎo)的 SD 大鼠體重波動(dòng)范圍較小，出現(xiàn)先小幅下降，第 3 周降為谷底，而后第 4 周小幅上升，并一直維持到第 9 周。第 9 周開(kāi)始藥物干預(yù)后，各組體重變化表現(xiàn)不一，第 12 周（給藥后 4 周）模型組大鼠體重呈繼續(xù)下降趨勢(shì)，野黃芩苷高中劑量組大鼠體重基本持平，并與模型組比較呈顯著差異（P<0.01）；野黃芩苷低劑量組大鼠體重仍呈下降趨勢(shì)，并與模型組比較無(wú)顯著差異（P>0.05）；立普妥組與血府逐瘀湯組大鼠體重也呈基本持平，并與模型組比較呈顯著差異（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)附表 4。

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本文編號(hào)：2813533