結(jié)腸癌為常見(jiàn)的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外近幾年的報(bào)道中也呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。5-氟尿嘧啶(5-FU)單用或聯(lián)合用藥至今仍用于胃腸道惡性腫瘤的一線治療。但因具有天然的耐藥性,患者易對(duì)其產(chǎn)生耐藥而使總體有效率降低。葛根素是葛根的主要有效成分,現(xiàn)代藥理研究表明葛根素可以通過(guò)抑制DNA的合成,抑制cox-2基因表達(dá)等作用表現(xiàn)其抗癌作用,對(duì)人的膽管癌QBC939細(xì)胞,胰腺癌PANC-1細(xì)胞,肺癌H446細(xì)胞等多種癌細(xì)胞均有明顯的生長(zhǎng)抑制和促凋亡作用。此外,葛根素與其他化療藥合用可表現(xiàn)協(xié)同作用,提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率。化療藥物的耐藥性多與外排蛋白表達(dá)有關(guān),因此從外排蛋白的角度闡述機(jī)理具有較大研究意義。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是影響藥物吸收和分布的一類(lèi)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其在腸道細(xì)胞中分布廣泛。其中P-gp能主動(dòng)泵出進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物使腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物蓄積減少,其過(guò)度表達(dá)是腫瘤的多藥耐藥性的重要機(jī)制之一。目前發(fā)現(xiàn)的可以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象的化藥中,大多毒性強(qiáng)、成本高,限制了臨床應(yīng)用。中藥單體成分作為化療增敏劑具有一定的潛力。為探尋葛根素能否增加化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率及其可能的作用機(jī)制,結(jié)合前期葛根芩連方的研究結(jié)果,擬通過(guò)比較經(jīng)典化療藥五氟尿嘧啶單獨(dú)給藥與葛根素和五氟尿嘧啶聯(lián)合給藥對(duì)人結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞Caco-2的抑制作用和對(duì)實(shí)體瘤的抑制率。并以P-gp為研究對(duì)象,進(jìn)一步從蛋白功能和能量角度探尋其可能的作用機(jī)制。1.藥效研究穩(wěn)定培養(yǎng)了人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)及傳代良好。利用MTT法測(cè)定葛根素與5-FU單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥對(duì)Caco-2細(xì)胞抑制率的影響。將葛根素與5-FU聯(lián)合用藥,與單用相比,可明顯降低Caco-2細(xì)胞的存活率。單獨(dú)用藥時(shí),葛根素對(duì)Caco-2細(xì)胞的IC50為3404.53 μM,5-FU對(duì)Caco-2細(xì)胞的IC50為190.64μM,聯(lián)合用藥時(shí),葛根素和5-FU對(duì)Caco-2細(xì)胞的IC50為別為1475.06μM和92.19μM,證明葛根素與5-FU聯(lián)合使用能協(xié)同增加對(duì)Caco-2細(xì)胞的抑制作用。通過(guò)Hoechst 33258和流式細(xì)胞術(shù)比較聯(lián)合用藥與單獨(dú)給藥對(duì)Caco-2細(xì)胞凋亡和周期的影響。Hoechst 33258染色后,加藥組與對(duì)照組相比,葛根素對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)明顯的促凋亡作用,5-FU對(duì)Caco-2細(xì)胞有顯著的促凋亡作用,聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率與5-FU組相比無(wú)明顯差異,證明葛根素與5-FU聯(lián)用對(duì)Caco-2細(xì)胞的無(wú)明顯協(xié)同促凋亡作用。并且在流式結(jié)果中也得到證實(shí)。在周期檢測(cè)中,與空白對(duì)照組相比,葛根素組能顯著提高GO/G1期細(xì)胞的比例(P0.001),并降低S期細(xì)胞的比例(P0.05)。單獨(dú)用藥組與聯(lián)合用藥組相比,GO/G1期細(xì)胞的比例具有顯著性差異(P0.001),證明葛根素能將細(xì)胞周期阻滯于GO/G1期,并能協(xié)同5-FU阻滯細(xì)胞周期,從而抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)。5-FU單用與葛根素和5-FU合用組可以顯著性抑制裸鼠皮下瘤的生長(zhǎng),葛根素雖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異,但葛根素組平均腫瘤體積是對(duì)照組的0.59倍,平均瘤重是對(duì)照組的0.57倍,腫瘤的體積和腫瘤重量的均值均比對(duì)照組小,分析可能由于樣本數(shù)量較少,腫瘤在體內(nèi)的增長(zhǎng)組內(nèi)差異較大,影響了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.機(jī)制研究研究葛根素對(duì)Caco-2MDR1基因與P-gp表達(dá)量的影響,從蛋白基因表達(dá)的角度闡述其對(duì)P-gp的影響。通過(guò)q-pcr檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看,與空白組相比將葛根素單獨(dú)給藥和與5-FU聯(lián)合用藥,可以顯著性的降低P-gp MDR1基因表達(dá)量。研究葛根素對(duì)P-gp ATP酶活性以及細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響,從能量依賴的角度闡述其對(duì)P-gp外排功能的影響。根據(jù)發(fā)出光的強(qiáng)度與ATP的濃度成正比的原理。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線用化學(xué)發(fā)光熒光分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)發(fā)光值,計(jì)算ATP含量,表明當(dāng)葛根素與5-FU聯(lián)合用藥時(shí)可以顯著性的降低細(xì)胞內(nèi)ATP含量。通過(guò)比較經(jīng)P-gp ATP酶選擇性抑制劑Na3V04進(jìn)行處理和未經(jīng)處理樣品間的信號(hào)差異,測(cè)試化合物對(duì)P-gp ATP酶活性的影響,表明當(dāng)葛根素與5-FU聯(lián)合用藥時(shí)可以顯著性的降低細(xì)胞內(nèi)ATP酶活性,從而抑制蛋白。通過(guò)Docking分析,以P-gp為藥物靶點(diǎn),比較葛根素與P-gp天然配體結(jié)合能力比較ATP與葛根素對(duì)蛋白的結(jié)合能力,通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)接出的結(jié)果可以看到,葛根素與P-gp的得分為6.435,而ATP與P-gp的結(jié)合活性為5.700。葛根素的Docking Score數(shù)值更大,說(shuō)明葛根素與P-gp的結(jié)合活性大于ATP與P-gp的結(jié)合活性,更容易與蛋白結(jié)合。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R285.5

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6 王s

本文編號(hào)：2812472