發(fā)布時(shí)間：2020-09-03 15:19

　　 目的:通過(guò)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞株,觀察和絡(luò)泄?jié)岱綄?duì)細(xì)胞miR-200a、miR-29c表達(dá)的影響,探討和絡(luò)泄?jié)岱皆谥委熌I間質(zhì)纖維化方面的應(yīng)用。方法:1.選30只雄性SPF級(jí)3月齡大鼠用于和腎絡(luò)大鼠含藥血清的提取。30只大鼠隨機(jī)分為兩組:正常大鼠血清組和和腎絡(luò)大鼠含藥血清組。成人和腎絡(luò)顆粒用量為30g/d,按“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積等效量換算比率”可算出大鼠的等效劑量。大鼠為人體劑量的10倍,約為和腎絡(luò)顆粒27g/d/kg。正常大鼠血清組大鼠每日給予等量的生理鹽水灌胃。灌胃第7天下午給藥后90min,各大鼠腹主動(dòng)脈取血10ml。離心取上清液,56℃水浴30min滅活補(bǔ)體,0.22um,濾器過(guò)濾除菌,-80℃冰箱保存。2.HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)和處理HK-2細(xì)胞在以5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,置37℃,5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí),將細(xì)胞按適當(dāng)濃度接種于6孔板中,待細(xì)胞約70%-80%融合時(shí),換成無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,使細(xì)胞同步化。3.實(shí)驗(yàn)分組、EMT誘導(dǎo)和后續(xù)培養(yǎng)TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT形成間充質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為4組,分別為:正常細(xì)胞組、TGF-β1組(濃度為10ng/ml)、TGF-β1+5%正常大鼠血清組、TGF-β1+5%含藥血清組,后續(xù)培養(yǎng)48h。4.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化將HK-2細(xì)胞以105/ml接種于預(yù)置無(wú)菌蓋玻片的6空板中培養(yǎng)至70%-80%融合時(shí),換成無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,使細(xì)胞同步化。按照上述分組方案,加入相應(yīng)藥物,置37℃,5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,采用倒置相差顯微鏡觀察EMT過(guò)程中各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,并拍照。5.Western Blot檢測(cè)α-SMA、E-cadherin等的變化。6.miR-200a、miR-29c表達(dá)的檢測(cè)根據(jù)Takara公司逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明合成第一條cDNA鏈,以cDNA為模板,U6小核RNA作為內(nèi)參,進(jìn)行SYBR Green定量PCR擴(kuò)增。每份RNA樣品均進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)驗(yàn),采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。7.分析miR-200a、miR-29c表達(dá)的改變,說(shuō)明和絡(luò)泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化的影響機(jī)制。結(jié)果:經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)36h后(B組),HK-2細(xì)胞內(nèi)α-SMA的表達(dá)較對(duì)照組(A組)顯著增加(P0.05),E-cadherin的表達(dá)顯著減少(P0.01),miR-200a、miR-29c的表達(dá)較對(duì)照組(A組)均顯著減少(P0.05);經(jīng)5%普通大鼠血清后續(xù)培養(yǎng)48h后(C組),可見(jiàn)α-SMA、E-cadherin及miR-200a、miR-29c的表達(dá)改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而經(jīng)5%大鼠含藥血清后續(xù)培養(yǎng)48h后(D組),可見(jiàn)α-SMA表達(dá)較B組顯著減少(P0.05),E-cadherin的表達(dá)顯著增加(P0.05),miR-200a、miR-29c表達(dá)較B組均有顯著升高(P0.05)。結(jié)論:和絡(luò)泄?jié)岱娇梢栽黾親K-2細(xì)胞中miR-200a和miR-29c的表達(dá)量,延緩腎間質(zhì)纖維化過(guò)程。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

結(jié) 果-2 細(xì)胞成功建立腎間質(zhì)纖維化模型變常的 HK-2 細(xì)胞呈典型的鋪路石樣，細(xì)胞間聯(lián)，細(xì)胞喪失鋪路石樣形態(tài)學(xué)特征，開(kāi)始變長(zhǎng)，變是仍然還有一部分為上皮細(xì)胞的形態(tài)（B）。herin 表達(dá)變化 TGF-β1 誘導(dǎo) 36h 后，可見(jiàn)細(xì)胞中 E-cadheri胞中顯著下降(P<0.05)；α-SMA 的條帶明顯增升（P<0.05），提示造模成功。

GF-β1 誘導(dǎo) 36h 后，細(xì)胞喪失鋪路石樣形態(tài)學(xué)特征，開(kāi)始變長(zhǎng)，變?yōu)樗笮危尸F(xiàn)成維細(xì)胞樣外觀，但是仍然還有一部分為上皮細(xì)胞的形態(tài)（B）。.1.2α-SMA、E-cadherin 表達(dá)變化如圖 2 所示，經(jīng) TGF-β1 誘導(dǎo) 36h 后，可見(jiàn)細(xì)胞中 E-cadherin 的條帶變細(xì)，其達(dá)量較正常 HK-2 細(xì)胞中顯著下降(P<0.05)；α-SMA 的條帶明顯增粗，其表達(dá)量較常 HK-2 細(xì)胞顯著上升（P<0.05），提示造模成功。圖 1 TGF-β1 誘導(dǎo)前后 HK-2 細(xì)胞形態(tài)變化注：其中 A 為正常細(xì)胞，B 為經(jīng) TGF-β1 誘導(dǎo) 36h 后的細(xì)胞。

TGF-β1 誘導(dǎo)后，部分細(xì)胞喪失鋪路石樣形態(tài)學(xué)特征，開(kāi)始變長(zhǎng)，變?yōu)樗笮危尸F(xiàn)成纖維細(xì)胞樣外觀，但是仍然還有一部分為上皮細(xì)胞的形態(tài)（B）；經(jīng)過(guò) 5%普通大鼠血清后續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞與 TGF-β1 誘導(dǎo)后細(xì)胞相比形態(tài)無(wú)明顯差異（C）；而經(jīng)過(guò) 5%含藥大鼠血清后續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞與 TGF-β1 誘導(dǎo)后細(xì)胞相比形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞逐漸變短，逐漸恢復(fù)至正常形態(tài)（D）。

【參考文獻(xiàn)】

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