發(fā)布時間：2020-08-27 19:14

【摘要】：本論文研究工作為國家自然科學基金項目—“丹參-紅花配伍活血化瘀功效物質與協(xié)同增效相互作用研究”(81573714)和江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”項目(BRA2016387)中的部分研究內容。論文共分為四章,具體的研究內容與實驗結果如下:第一章文獻研究第一節(jié)活血化瘀藥對的研究進展本文系統(tǒng)綜述了活血化瘀藥對的配伍規(guī)律,為后期活血化瘀藥對配伍效應與物質基礎研究奠定理論基礎。第二節(jié)丹參-紅花配伍研究進展本文系統(tǒng)綜述了丹參-紅花配伍的制劑應用,化學成分,藥代動力學、藥理作用和系統(tǒng)生物學研究。第二章丹參-紅花藥對配伍效應物質基礎研究第一節(jié)藥材采集與樣品制備稱取丹參、紅花及其藥對(3:1)藥材各5 kg,進行熱回流水提取,分別得到丹參、紅花和丹參-紅花樣品,冷藏備用。第二節(jié)基于“化學模糊識別”策略的丹參-紅花配伍化學成分變化規(guī)律研究采用HPLC-PDA技術和“化學模糊識別”策略對丹參-紅花藥對不同配比的活性物質變化規(guī)律進行了系統(tǒng)研究。通過建立丹參與紅花的化學物質庫,并經(jīng)過對照品峰的紫外信息,建立了四類活性物質(丹酚酸類,丹參酮類、醌式查爾酮類和黃酮類)的紫外信號網(wǎng)絡,并通過網(wǎng)絡將丹參-紅花中的成分進行快速鑒別與歸類,進而通過對稱配比設計對這些化合物進行定量分析。在丹參-紅花配伍的水煎液中,通過“化學模糊識別”策略分別鑒定出47個成分,其中,15個丹酚酸類成分,20個醌式查爾酮類成分,12個黃酮類成分。不同配比中,在5:1～5:2的范圍內所測成分總的相對溶出度較高,總的相對溶出度最高時丹參、紅花配比為5:2。結果表明不同配伍比例的丹參-紅花中不同化學成分的配伍變化規(guī)律有所不同,且存在較優(yōu)配比,為丹參-紅花藥對臨床配伍合理應用提供了參考,為藥對現(xiàn)代基礎研究提供了思路與方法。第三節(jié)基于UHPLC-TQ/MS技術的丹參-紅花配伍前后主要效應成分變化研究本實驗首次建立了一種13分鐘內快速有效的同時測定丹參-紅花藥對及其單味藥中15個活性成分(酚酸和黃酮類)含量的超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜法(UHPLC-TQ/MS)。該方法具有良好的線性(r20.9975),檢測限(1.12～7.01ngmL-1),定量限(3.73～23.37ngmL-1),精密度(RSD≤1.92%,RSD≤2.45%),穩(wěn)定性(RSD≤≤5.63%),重復性(RSD≤ 4.34%),回收率(96.84%～102.12%)和基質效應(0.92～1.02)。用該方法比較評價丹參、紅花配伍前后主要活性成分含量變化發(fā)現(xiàn),與單味藥相比,丹參素、6-羥基山奈酚-3-O-蕓香糖苷-6-O-葡萄糖苷、原兒茶醛、咖啡酸、蘆丁、脫水紅花黃色B、山奈酚-3-O-蕓香糖苷和山奈酚含量配伍后顯著增加,增加率分別為45.24%、14.12%、21.68%、86.00%、31.62%、4.63%、19.73%和56.60%。丹參、紅花配伍前后活性成分含量的變化可能是引起藥對協(xié)同增效作用的一個重要因素。該方法為丹參-紅花藥對的質量控制和藥物相互作用研究提供了理論基礎和參考。第三章丹參-紅花活血化瘀配伍效應研究第一節(jié)丹參-紅花體外活血化瘀量效關系研究本實驗基于體外抗氧化(DPPH、ABTS、OH·自由基清除法及FRAP法)、抑制血小板聚集(ADP)和抗凝血(TT、PT、APTT、FIB)活性評價,比較研究丹參-紅花配伍前后活血化瘀效應。結果表明,丹參、紅花和丹參-紅花藥對DPPH和ABTS的IC50分別102.00、61.61、60.36mgL-1和33.82、26.85、23.99mgL-1,各劑量組對Fe3+有較強的還原作用,呈現(xiàn)一定的量效關系;與空白組比較,除丹參低劑量組(0.031 gmL-1)外,其他各組對ADP誘導的血小板聚集率有顯著降低作用,呈現(xiàn)一定的量效關系;丹參、紅花和丹參-紅花藥對高劑量組(0.250、0.500、1.000 g mL-1)對TT均有顯著延長作用,且丹參-紅花藥對優(yōu)于單味藥;丹參-紅花藥對各劑量組對PT具有顯著延長作用;丹參、紅花配伍前后各劑量組對APTT均有顯著延長作用,且呈現(xiàn)一定的量效關系;同時,丹參-紅花藥對各劑量組顯著降低家兔血漿中FIB含量。綜合分析發(fā)現(xiàn),丹參-紅花藥對及其單味藥均有顯著地抗氧化、抑制血小板聚集和抗凝血作用,丹參、紅花配伍后活血化瘀效應有所增強,體現(xiàn)出一定的協(xié)同增效作用。第二節(jié)不同動物模型的丹參-紅花藥對活血化瘀量效關系比較研究本實驗采用急性血瘀和心肌缺血大鼠模型,觀察不同劑量丹參-紅花藥對活血化瘀效應。通過測定全血黏度(WBV)、血漿黏度(PV)、血沉(ESR),紅細胞壓積(HCT),凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶時間(APTT)、血漿纖維蛋白原(FIB)含量及血小板最大聚集率(ADP)觀察不同劑量丹參-紅花藥對對急性血瘀大鼠血液流變學,凝血功能及血小板聚集指標的影響。結果表明,與空白組比較,模型組大鼠血液流變學和凝血功能及血小板聚集指標均有顯著性差異;與模型組比較,丹參-紅花藥對低、中、高3個劑量給藥組均能較好地改善血瘀大鼠的血液流變學、凝血功能異常和血小板聚集,并呈一定的量效關系,最優(yōu)的給藥劑量為7.20 g kg-1。通過測定肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、內皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、前列環(huán)素(PGI2)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血栓素B2(TXB2)、6-酮前列腺素(6-Keto-PGF1α)、ATP酶和ATP含量觀察不同劑量丹參-紅花藥對(DH-1、3、5、10倍量)對急性心肌缺血大鼠的保護作用。結果表明,不同劑量丹參-紅花藥對急性心肌缺血大鼠的心肌酶、氧化水平、血管內皮功能、炎癥反應、血小板聚集和能量代謝異常具有保護改善作用,不同劑量組活血化瘀作用的大小順序為:DH-5DH-10DH-3DH-1,最優(yōu)的給藥劑量為丹參-紅花藥對藥典5倍量(9 gkg-1),同時優(yōu)選急性心肌缺血模型為后期整體動物模型。第三節(jié)基于急性心肌缺血模型大鼠的丹參-紅花活血化瘀配伍效應評價本實驗在前期丹參-紅花藥對活血化瘀量-效關系研究的基礎上,基于急性心肌缺血大鼠模型,通過測定心臟系數(shù)、肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸激酶(CK)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、內皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)比較研究丹參、紅花配伍前后活血化瘀效應變化。結果表明,丹參、紅花及其藥對能夠明顯改善異丙腎上腺素導致的心臟系數(shù)、肌鈣蛋白Ⅰ、心肌酶異常,部分調節(jié)大鼠體內脂質過氧化物的水平和清除氧自由基的能力,顯著改善ET-1和NO水平。進一步將各給藥組的藥效數(shù)據(jù)經(jīng)過主成分分析(PCA),采用各給藥組到空白組的相對距離法來比較活血化瘀效應。各給藥組的活血化瘀作用的大小順序為:丹參-紅花紅花丹參。除MDA水平外,丹參、紅花配伍對急性心肌缺血具有活血化瘀協(xié)同作用,可能與其降低肌鈣蛋白Ⅰ、心肌酶含量,抑制脂質過氧化和保護血管內皮細胞功能有關;通過整合效應成分含量變化后發(fā)現(xiàn),活性成分丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸B可能是丹參-紅花配伍效應的物質,具體機制有待進一步深入研究。第四章丹參-紅花配伍活血化瘀協(xié)同增效機制研究第一節(jié)丹參-紅花藥對在正常和急性心肌缺血模型大鼠體內的藥動學比較研究本實驗基于正常和異丙腎上腺素誘導大鼠急性心肌缺血模型,建立丹參中9個效應成分在大鼠血漿中的UHPLC-MS/MS的測定方法,比較評價丹參中主要效應成分配伍前后在正常和急性心肌缺血模型中的藥動學參數(shù)的變化,最終揭示丹參、紅花配伍活血化瘀效應的潛在物質基礎。結果表明,9個效應成分在血漿中的具有良好的線性關系(r2≥0.9958),日內和日間精密度分別小于11.53%和12.72%,準確度相對誤差在±10.88%范圍內,回收率和基質效應分別小于11.30%和10.36%。丹參、丹參-紅花單劑量灌胃給藥9gkg-1后,丹參中主要效應成分的半衰期較短,且在8小時內消除達90%。與單味藥組相比,除丹參素的T1/2顯著延長外,丹參中主要效應成分在配伍紅花后,藥動學行為變化差異不明顯;與正常組相比,模型組大鼠體內的原兒茶醛和咖啡酸T1/2、丹參素Tmax顯著延長,丹參各效應成分藥動學參數(shù)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞顯著增加,提示丹酚酸類成分可能跟丹參-紅花藥對改善心肌缺血損傷密切相關。第二節(jié)基于代謝組學的丹參-紅花配伍活血化瘀效應機制研究采用異丙腎上腺素誘導復制大鼠急性心肌缺血模型,基于代謝組學研究丹參-紅花配伍活血化瘀效應機制。首先,通過血清肌鈣蛋白Ⅰ、心肌酶和氧化水平指標(cTnI、CK、AST、LDH、MDA、SOD)檢測,評價比較丹參、紅花及其藥對對急性心肌缺血大鼠的心肌損傷保護作用;結果表明,與正常組比較,模型組大鼠血清中肌鈣蛋白Ⅰ、心肌酶和氧化水平顯著變化(P0.01),證明急性心肌缺血大鼠造模成功。與模型組比較,丹參、紅花和丹參-紅花組大鼠血清中cTnI、CK、AST、LDH和MDA水平均顯著降低,SOD活性明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01、0.05)。丹參、紅花配伍前后比較發(fā)現(xiàn),除MDA水平外,大鼠血清中cTnI、CK、AST、LDH和SOD水平均顯著變化(P0.01、0.05),丹參、紅花及其藥對對急性心肌損傷均具有保護作用,丹參-紅花藥對效果優(yōu)于單味藥。接著,基于代謝組學研究,從心肌缺血大鼠血清中初步鑒定得到12個潛在的差異性生物標志物。正離子模式下3個:葡萄糖,溶血卵磷脂LysoPC(18:2),LysoPC(20:3(8Z,11Z,14Z)),負離子模式下10個:膽酸,熊去氧膽酸,溶血卵磷脂LysoPC(20:4),LysoPC(22:6),LysoPC(18:2)(同正離子),LysoPC(16:0),LysoPC(18:0),棕櫚酸,二十二碳六烯酸,硬脂酸;構建相關通路分析,急性心肌缺血模型主要與碳水化合物代謝(淀粉和蔗糖代謝,半乳糖代謝)和脂代謝(甘油磷脂代謝,不飽和脂肪酸生物合成,脂肪酸生物合成,線粒體中脂肪酸延長,脂肪酸代謝,初級膽汁酸合成)密切相關。丹參-紅花藥對及其單味藥均可調節(jié)紊亂的生物標志物向正常轉歸,丹參、紅花及其藥對組比較,丹參-紅花組中葡萄糖、熊去氧膽酸、溶血卵磷脂LysoPC(20:4)、LysoPC(22:6)、LysoPC(18:0)、棕櫚酸、硬脂酸回調趨勢更顯著(P0.01、0.05),丹參-紅花藥對的活血化瘀整體效應優(yōu)于單味藥。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

南京中醫(yī)藥大學碩士學位論文邐逡逑化范圍為５：１？５：２。逡逑表２－２－１四個標準品的標準曲線及ＬＯＤ和ＬＯＱ結果逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－２－１邋Ｌｉｎｅａｒ邋ｅｑｕａｔｉｏｎｓ，邋ＬＯＰ邋ａｎｄ邋ＬＯＱ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ逡逑ＮＯ邐回歸方程邐ｒ２邐線性范圍（｜ｊｇ）邋ＬＯＤ邋（問）ＬＯＱ邋（ｔｉｇ）逡逑ＤＦＢ邐ｙ＝２３２４８３７１．５８ｘ＋７１３７．６５邐０．９９９９邐１７２．００邐？１．３４邐０．１４６６０邐０．５３８５逡逑ＤＳＴ邐ｙ＝１１２６０９５３９．４０ｘ＋５９０５．１４邐０．９９９４邐４２．７５邐？０．３３邐０．０４８１４邐０．２１３９逡逑ＨＳＹＡ邐ｙ＝５５０１６１３０．２７ｘ＋１２９８．０２邐０．９９９９邐１０２．５０邐？０．４０邐０．１１２４０邐０．３５２１逡逑ＨＴＧ邐ｙ＝７８３４６４５７．７８ｘ＋６２１３．３６邐０．９９９５邐８５．５５邐？０．３３邐０．０９１１７邐０．２０２１逡逑表２－２－２精密度、重復性、穩(wěn)定性和加樣回收率結果逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－２－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，邋ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ，邋ｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋ａｎｄ邋ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ邋ｒａｔｅ逡逑精密度ＲＳＤ／％邐重復性邐穩(wěn)定性邐加樣回收率逡逑ＮＯ．邋邐邐邐逡逑日內（《邋＝邋６）日間（７７邋＝邋３）邐（ＲＳＤ／％，邋ｎ邋＝邋６）邐（ＲＳＤ／％，邋？邋＝邋８）邋ＲＳＤ／％邋（ｎ邋＝邋９）逡逑ＤＦＢ邐０．５６邐３．７７邐０．７９邐３．７５邐９８．０１邐０．７７逡逑ＤＳＴ邐１．８１邐４．５４邐－邐－邐９４．８９邐１．６５逡逑ＨＳＹＡ邐０．

與正常組比較，模型組的凝血四項（ＡＰＴＴ、ＰＴ、ＴＴ、ＦＩＢ）和ＡＤＰ均有顯著性差異逡逑（尸＜０．０１），其中ＡＰＴＴ、ＰＴ和ＴＴ均明顯降低，ＦＩＢ和ＡＤＰ含量顯著升高。與模型組比逡逑較，丹參－紅花藥對低、中、高劑量組中，均有差異性顯著（Ｐ＜０．０１、０．０５）。結果見圖３－逡逑２－１－３。逡逑３．４基于多指標綜合指數(shù)法的丹參－紅花藥對的活血化瘀效應整合逡逑將各組大鼠所有指標的源數(shù)據(jù)導入ＭａｓｓＬｙｎｘ邋ｖ４．１邋（Ｗａｔｅｒｓ公司）軟件的ＥＺ邋ｉｎｆｏ中，逡逑采用偏最小二乘法分析得到各個指標的ＶＩＰ值（圖３－２－１－４），ＶＩＰ值越大，說明在本實驗逡逑中該指標對分類的貢獻越大［１１］。如圖３－２－１－４顯示，ＷＢＶ邋（ＩＳ－１）、ＨＣＴ、ＦＩＢ和ＡＰＴＴ的逡逑ＶＩＰ邋值均大于邋１，ＰＶ、ＷＢＶ邋（５Ｓ－１）、ＴＴ、ＷＢＶ邋（３０Ｓ－１）、ＷＢＶ邋（２００Ｓ－１）、ＥＳＲ、ＡＤＰ邋和逡逑ＰＴ的ＶＩＰ值較小。采用本課題組前期的多指標綜合指數(shù)法對各指標進行歸一化處理，得逡逑到各組的總活血化瘀效應值（表３－２－１－１），進而得到不同劑量的丹參－紅花藥對的總活血效逡逑應值。結果表明，丹參－紅花藥對水提取物在實驗劑量范圍內，隨著劑量的增加，各組的活逡逑血作用均有所加強

與正常組比較，模型組的凝血四項（ＡＰＴＴ、ＰＴ、ＴＴ、ＦＩＢ）和ＡＤＰ均有顯著性差異逡逑（尸＜０．０１），其中ＡＰＴＴ、ＰＴ和ＴＴ均明顯降低，ＦＩＢ和ＡＤＰ含量顯著升高。與模型組比逡逑較，丹參－紅花藥對低、中、高劑量組中，均有差異性顯著（Ｐ＜０．０１、０．０５）。結果見圖３－逡逑２－１－３。逡逑３．４基于多指標綜合指數(shù)法的丹參－紅花藥對的活血化瘀效應整合逡逑將各組大鼠所有指標的源數(shù)據(jù)導入ＭａｓｓＬｙｎｘ邋ｖ４．１邋（Ｗａｔｅｒｓ公司）軟件的ＥＺ邋ｉｎｆｏ中，逡逑采用偏最小二乘法分析得到各個指標的ＶＩＰ值（圖３－２－１－４），ＶＩＰ值越大，說明在本實驗逡逑中該指標對分類的貢獻越大［１１］。如圖３－２－１－４顯示，ＷＢＶ邋（ＩＳ－１）、ＨＣＴ、ＦＩＢ和ＡＰＴＴ的逡逑ＶＩＰ邋值均大于邋１，ＰＶ、ＷＢＶ邋（５Ｓ－１）、ＴＴ、ＷＢＶ邋（３０Ｓ－１）、ＷＢＶ邋（２００Ｓ－１）、ＥＳＲ、ＡＤＰ邋和逡逑ＰＴ的ＶＩＰ值較小。采用本課題組前期的多指標綜合指數(shù)法對各指標進行歸一化處理，得逡逑到各組的總活血化瘀效應值（表３－２－１－１），進而得到不同劑量的丹參－紅花藥對的總活血效逡逑應值。結果表明，丹參－紅花藥對水提取物在實驗劑量范圍內，隨著劑量的增加，各組的活逡逑血作用均有所加強

【參考文獻】

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本文編號：2806508