【摘要】：目的:以HSC-T6細(xì)胞為模型,探索齊墩果酸(Oleanic acid,OA)導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)制。方法:1.觀察OA對(duì)HSC-T6細(xì)胞的影響通過MTT法篩選OA濃度后,設(shè)置空白組、低劑量組(10μM)、中劑量組(20μM)、高劑量組(40μM),給予齊墩果酸24 h后,采用WB法檢測α-SMA、SHH、TGF-β1、Smad2與核內(nèi)Nrf2、Gli2蛋白水平,ELISA法檢測培養(yǎng)基中Ⅰ型膠原含量。2.建立Nrf2的轉(zhuǎn)染與激動(dòng)以及HH通路、TGF通路的沉默方法(1)采用siRNA方法處理HSC-T6細(xì)胞,RT-PCR法檢測Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLC、GCLM mRNA表達(dá),WB法檢測核內(nèi)Nrf2蛋白水平;(2)采用5μM SFN處理HSC-T6細(xì)胞24 h后,檢測Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLC、GCLM mRNA表達(dá)和核內(nèi)Nrf2蛋白水平;(3)將1μM吡非尼酮與HSC-T6細(xì)胞共同孵育24 h后,檢測TGF-β1mRNA水平與蛋白水平;(4)HSC-T6細(xì)胞用8μM的Gant-61處理24 h后,檢測核內(nèi)Gli2蛋白水平。3.探討Nrf2通路、HH通路與TGF通路對(duì)OA導(dǎo)致肝纖維化的作用(1)分別用0,10,20,40μM的OA與正常的及si Nrf2 HSC-T6細(xì)胞共孵育;(2)給予0,10,20,40μM的OA,同時(shí)將5μM SFN與0,10,20,40μM的OA聯(lián)合給藥;(3)給予0,10,20,40μM的OA同時(shí)設(shè)置平行組在給予OA的同時(shí)給予8μM Gant-61。給藥24 h后,檢測8個(gè)組α-SMA蛋白水平與Ⅰ型膠原含量;(4)設(shè)置空白組、OA低劑量組、OA中劑量組、OA高劑量組、吡非尼酮組、吡非尼酮+OA低劑量組、吡非尼酮+OA中劑量組、吡非尼酮+OA高劑量組;結(jié)果:1.給予OA 24 h后,中、高劑量組α-SMA與Ⅰ型膠原含量明顯增多,表明大劑量的OA能導(dǎo)致HSC-T6細(xì)胞的活化。與空白組相比,中、高劑量組核內(nèi)Nrf2蛋白水平上調(diào),SHH與、Gli2蛋白水平上調(diào),高劑量組TGF-β1、Smad2蛋白水平上調(diào)。2.PCR結(jié)果顯示siRNA處理后Nrf2下游HO-1、NQO1、GCLC、GCLM mRNA水平明顯下調(diào),WB結(jié)果顯示siRNA方法能夠顯著降低核內(nèi)Nrf2蛋白水平,表明siRNA沉默Nrf2成功;空白組與低劑量組采用siRNA沉默Nrf2后,α-SMA蛋白水平上調(diào)、Ⅰ型膠原含量增多;高劑量組采用siRNA沉默Nrf2后,α-SMA蛋白水平下調(diào)、Ⅰ型膠原含量減少。3.給予SFN后,Nrf2下游基因mRNA水平明顯升高,核內(nèi)Nrf2蛋白水平明顯升高,表明SFN能夠激動(dòng)Nrf2蛋白水平;SFN與OA聯(lián)合給藥后,發(fā)現(xiàn)SFN能使HSC-T6細(xì)胞α-SMA蛋白水平下調(diào),Ⅰ型膠原含量降低。4.給予Gant-61后,核內(nèi)Gli2蛋白水平明顯降低,表明Gant-61能有效抑制HH通路;與OA聯(lián)合給藥后,α-SMA蛋白水平明顯下調(diào),Ⅰ型膠原含量降低。5.吡非尼酮能夠顯著降低TGF-β1 mRNA水平以及蛋白水平,表明吡非尼酮是TGF-β1的有效抑制劑;與OA各劑量組相比,給予吡非尼酮后HSC-T6細(xì)胞的α-SMA蛋白水平下調(diào),Ⅰ型膠原含量降低。結(jié)論:大劑量的OA可以導(dǎo)致HSC-T6細(xì)胞活化,Nrf2通路在OA所致肝纖維化的過程中起部分保護(hù)作用,OA可能通過HH通路與TGF-β通路導(dǎo)致肝纖維化。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

161 傳代前與傳代后 24, 48, 72 h α-SMA 蛋白水平與Ⅰ型膠原篩選藥物濃度A 給藥劑量為 0、10、20、40 μM；Nrf2 激動(dòng)劑 SF；TGF-β1 抑制劑吡非尼酮的濃度為 0、0.5、1、2 μ0、1、2、3、8 μM，進(jìn)一步檢驗(yàn)激動(dòng)劑/抑制劑各濃（圖 2）。

給予OA后α-SMA蛋白水平與Ⅰ型膠原含量響（與空白組相比*P<0.05，與低劑量組相比#P<0.05，n=3）

給予OA后核內(nèi)Nrf2蛋白水平（與空白組相比*P<0.05，n=3）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2805810