【摘要】：目的:采用大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞建立離體腦“神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)”共培養(yǎng)模型,并觀察β-石竹烯(β-Caryophyllene,BCP)對其缺氧復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation,OGD/R)損傷的保護作用。方法:1.(1)大鼠BMECs、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)方法分別如下:1)分離2周齡SD乳鼠的腦皮層組織,加入Ⅱ-型膠原酶和膠原酶/分散酶消化腦組織,20%BSA分離微血管段,消化傳代純化細胞,免疫熒光法(Immunofluorescence technique,IF)檢測內(nèi)皮細胞特異性蛋白Ⅷ因子(FactorⅧ)進行鑒定細胞純度。2)分離24 h內(nèi)新生SD乳鼠的皮層組織,加入0.125%的胰酶消化,用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng),通過振搖法純化細胞,IF檢測星形膠質(zhì)細胞特異性酸性膠質(zhì)纖維蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)鑒定細胞純度。3)分離胚胎期17-19 d的SD乳鼠的腦皮層組織,先用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞4-6 h,再改用Neurobasal+B27培養(yǎng)基培養(yǎng),IF檢測神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白(microtubuleassociatedprotein,map-2)鑒定細胞純度。(2)共培養(yǎng)模型的構(gòu)建:采用transwell細胞小室共培養(yǎng)細胞。神經(jīng)元于孔板底部生長至第5d后直接用于建模,transwell膜的外側(cè)接種傳代純化后的星形膠質(zhì)細胞,依靠張力作用5h后將其放入接種有神經(jīng)元的孔板中,24h后于transwell膜的內(nèi)池接種傳代純化后的bmecs,共培養(yǎng)3d后用于后續(xù)實驗。并通過以下指標鑒定nvu模型:4h滲漏實驗和跨內(nèi)皮細胞電阻值(transendothelialelectricalresistance,teer)初步鑒定模型。相差顯微鏡和掃描電鏡觀察共培養(yǎng)模型中細胞的生長狀態(tài)、透射電鏡觀察內(nèi)皮細胞間的緊密連接(tightjunction,tj)、伊文思藍(evansblue,eb)檢測模型的通透性。2.構(gòu)建離體nvu缺氧復(fù)氧損傷模型,分為正常對照組(controlgroup),缺氧復(fù)氧損傷組(ogd/rgroup),β-石竹烯組(bcp+ogd/rgroup,10μmol/l)。并通過以下指標觀察β-石竹烯的保護作用:檢測teer以及eb滲透率反應(yīng)nvu通透性的變化、明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9(metalloproteinase-9,mmp-9)的活性,westernblot檢測tj蛋白、凋亡相關(guān)蛋白以及生長相關(guān)蛋白-43(growth-associatedprotein-43,gap-43)表達、流式細胞儀檢測神經(jīng)元凋亡情況、免疫酶聯(lián)法(elisa)檢測nfg-β,sod、mda、ldh、no、tnf-α、il-1β、il-6的表達。結(jié)果:1.成功培養(yǎng)3種原代細胞。(1)bmecs呈典型的渦旋狀生長,特異性factor-Ⅷ鑒定純度可達96%以上。(2)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)振搖傳代處理后GFAP鑒定純度達97%以上。(3)神經(jīng)元細胞MAP-2鑒定純度可達90%以上。(4)三細胞共培養(yǎng)中細胞生長狀態(tài)良好,并有相互促進生長的作用。4h滲漏試驗中各孔液面均無明顯下降,TEER值顯著高于雙細胞和單細胞培養(yǎng),EB滲透率明顯低于雙細胞和單細胞培養(yǎng),3細胞共培養(yǎng)模型中內(nèi)皮細胞之間形成了具有屏障功能的TJ結(jié)構(gòu)和橋粒結(jié)構(gòu)。2.BCP對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的離體NVU模型損傷具有保護作用:BCP可顯著降低TNF-α、IL-1β、IL-6,MDA、LDH、MMP-9以及促凋亡蛋白Bax的表達量(P0.05),上調(diào)緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1、GAP-43、NFG-β、SOD以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達量(P0.05)。結(jié)論:1.三細胞共培養(yǎng)模型中細胞之間可相互促進生長,能更好地模擬在體復(fù)雜的生理環(huán)境,與在體NVU具有部分相似的生理功能。2.β-石竹烯對缺氧復(fù)氧損傷的離體NVU模型具有顯著的保護作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2801818