發(fā)布時(shí)間：2020-08-23 15:30

【摘要】：眾所周知,bFGF對創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的研究具有非常重要的意義,因其能夠有效地促進(jìn)傷口的愈合以及抑制瘢痕的形成,使其在醫(yī)療、美容領(lǐng)域具有良好的開發(fā)前景。但是目前市售的bFGF生長因子多數(shù)為原核及酵母系統(tǒng)表達(dá),導(dǎo)致bFGF分離純化成本高,蛋白不穩(wěn)定,一旦溶解在溶液中,就必須儲存在低溫條件下(4℃),并在2周內(nèi)使用完畢,不易保存。因此,開發(fā)bFGF新型表達(dá)純化系統(tǒng),改良bFGF的藥物劑型,使其在室溫條件下儲存更加穩(wěn)定具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室選用植物油體作為bFGF的表達(dá)載體,分離純化方法簡單易操作。并選用凍干粉作為藥物劑型,能夠有效地延長產(chǎn)品的存儲時(shí)間,方便產(chǎn)品的運(yùn)輸及儲存,有效地降低了bFGF產(chǎn)品的生產(chǎn)和運(yùn)輸成本。為進(jìn)一步確定融合表達(dá)bFGF蛋白的亞麻芥油體凍干粉(oleosin-bFGF)的穩(wěn)定性和皮膚給藥毒性,為后續(xù)oleosin-bFGF凍干粉產(chǎn)品的開發(fā)、質(zhì)量和安全標(biāo)準(zhǔn)體系的建立奠定基礎(chǔ)。本研究通過對oleosin-bFGF凍干粉的影響因素、加速穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性進(jìn)行考察,確定其存儲條件及存儲時(shí)間;其次通過初步研究oleosin-bFGF凍干粉的急性和亞慢性皮膚給藥毒性,對其進(jìn)行藥物安全性評價(jià)。主要研究結(jié)果如下:1.通過檢測在60℃高溫、高濕度及強(qiáng)光光照條件下放置的oleosin-bFGF凍干粉的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn),oleosin-bFGF凍干粉在高溫、高濕條件下外觀、鏡檢、pH值、蛋白含量以及促細(xì)胞增殖活性呈較明顯的下降趨勢;光照條件下以上檢測指標(biāo)變化不明顯。說明oleosin-bFGF凍干粉主要在高溫和高濕度環(huán)境下不穩(wěn)定,因此oleosin-bFGF凍干粉在儲存運(yùn)輸過程中應(yīng)避免40℃以上高溫,并采用真空密封包裝,2.經(jīng)加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(6個(gè)月)和長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(12個(gè)月),驗(yàn)證oleosin-bFGF凍干粉的外觀,鏡檢,pH值,蛋白含量,促細(xì)胞增殖效果以及無菌檢測結(jié)果均未發(fā)生明顯變化。說明其常溫穩(wěn)定性良好,打破市售bFGF凍干粉只能低溫保存的局限性。3.通過對大鼠一次性皮膚給藥發(fā)現(xiàn),即使是高劑量的oleosin-bFGF凍干粉對大鼠也無明顯影響,所有大鼠均未出現(xiàn)中毒跡象,實(shí)驗(yàn)組大鼠活躍度正常,幾乎沒有可察覺的紅斑及水腫。對實(shí)驗(yàn)組和對照組的體重變化及臟體比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著差異,oleosin-bFGF凍干粉的最大耐受劑量為2000 mg/kg。4.對大鼠連續(xù)皮膚給藥28天發(fā)現(xiàn),即使是持續(xù)給藥的條件下,oleosin-bFGF凍干粉對大鼠的一般狀態(tài),體重變化,血常規(guī)及血液生化指標(biāo),臟器系數(shù),組織病理學(xué)檢查均無明顯影響,所有大鼠均沒有中毒跡象發(fā)生。說明oleosin-bFGF凍干粉皮膚給藥安全性良好,符合OECD準(zhǔn)則的要求,值得進(jìn)一步研發(fā)推廣。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R283.6
【圖文】：

的人工氣候箱內(nèi)放置 12 個(gè)月。所用設(shè)備應(yīng)能控制相對濕度在±5能對真實(shí)溫度與濕度進(jìn)行監(jiān)測。在試驗(yàn)期間的第 3 個(gè)月、第 6 個(gè)月月末分別取樣一次（每 3 個(gè)月檢測一次，每次隨機(jī)取樣 5 瓶），對 ol外觀、顯微鏡結(jié)構(gòu)、pH 值變化、oleosin-bFGF 油體蛋白含量、微生物對其促細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行分析，并與培養(yǎng) 0 天的 oleosin-bFGF 凍干查結(jié)果進(jìn)行比較分析，觀察各項(xiàng)指標(biāo)在不同時(shí)間的變化情況GF 凍干粉在常溫條件下的穩(wěn)定性，借以確定 oleosin-bFGF 凍干粉與分析佳預(yù)凍條件預(yù)凍溫度篩選結(jié)果察預(yù)凍溫度分別-20℃，-40℃，-80℃，預(yù)凍時(shí)間為 12 h，生產(chǎn)的 ol發(fā)現(xiàn)當(dāng)預(yù)凍溫度為-80℃時(shí)，oleosin-bFGF 凍干粉的凍干效果最好，沒發(fā)生，顏色也較為白皙。而且從 oleosin-bFGF 凍干粉的油體蛋白顯微預(yù)凍溫度為-80℃時(shí)，oleosin-bFGF 凍干粉的油體蛋白破裂融合數(shù)目油體蛋白破裂融合現(xiàn)象（圖 2-1）。-20℃ -40℃ -80℃

（2）最佳預(yù)凍時(shí)間篩選結(jié)果根據(jù) oleosin-bFGF 凍干粉的最佳預(yù)凍溫度篩選結(jié)果（最佳預(yù)凍溫度為-80℃），篩選oleosin-bFGF 凍干粉的最佳預(yù)凍時(shí)間，發(fā)現(xiàn)當(dāng)預(yù)凍時(shí)間為 10 h，11 h 的 oleosin-bFGF 凍干粉的凍干效果是最好的，從其外觀可以看出，當(dāng)預(yù)凍時(shí)間為 10 h，11 h 時(shí)，oleosin-bFGF凍干粉沒有氣泡和噴瓶現(xiàn)象，顏色相對其他預(yù)凍時(shí)間也較為白皙。而且預(yù)凍時(shí)間為 10 h11 h 時(shí)的 oleosin-bFGF 凍干粉的鏡檢結(jié)果也更好，相比于其他預(yù)凍時(shí)間，油體蛋白破裂融合數(shù)目較少，油體蛋白分布更加均勻（圖 2-2）。1 h 2 h 3 h 4 h

oleosin-bFGF 凍干粉油體蛋白出現(xiàn)明顯的破裂、聚集現(xiàn)象（圖 2-3）并開始出現(xiàn)斷裂、結(jié)塊等現(xiàn)象，pH 值明顯下降，復(fù)溶性也開始變慢（leosin-bFGF 凍干粉內(nèi)的 oleosin-bFGF 含量逐漸變低（圖 2-4、2-5），ole細(xì)胞增殖效果明顯減弱，生物活性降低（圖 2-6）。所述，說明溫度對于 oleosin-bFGF 凍干粉的油體蛋白有一定的影響，結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，進(jìn)而對其穩(wěn)定性造成影響。因此，本實(shí)驗(yàn)建議 oleosi輸及存儲過程中應(yīng)該盡量避免 40℃高溫環(huán)境對其造成影響。表 2-1 高溫條件下放置不同時(shí)間的產(chǎn)品性狀Table 2-1 Product changed at different duration under high temperature condition時(shí)間/d 外觀 pH 值 復(fù)溶性 Oleosin-bFGF 的0 白色，疏松 7.51 快 0.2145 白色，結(jié)塊 7.38 較慢 0.1860 米黃色，結(jié)塊 7.21 慢 0.1120 d 5 d 10 d

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本文編號：2801693