發(fā)布時間：2020-08-23 14:42

【摘要】：目的本研究針對復雜性疾病類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA),選擇臨床治療痹證的經(jīng)典名方白虎加桂枝湯(Baihu-Guizhi decoction,BHGZD作為研究對象,開展全基因組表達譜芯片檢測與網(wǎng)絡藥理學分析的整合研究,按照“BHGZD化學成分庫的建立→候選靶標預測→“疾病基因-藥物候選靶標”相互作用網(wǎng)絡的建立和分析→BHGZD干預RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡靶標篩選及作用機制挖掘→實驗驗證”的研究路線,從“炎癥-免疫”網(wǎng)絡角度切入,初步鑒定該方的物質(zhì)基礎(chǔ),揭示該方干預RA的作用機制并篩選其關(guān)鍵靶標。方法1.佐劑誘導性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-Induced Arthritis,AIA)動物模型的構(gòu)建及BHGZD干預RA的藥效學評價1.1 AIA動物模型的建立選用健康6～7周齡(體重200±20g)的雄性Lewis大鼠,每只大鼠尾根單次皮內(nèi)注射0.1mL完全弗氏佐劑,建立AIA大鼠模型。1.2動物分組、給藥及取材雄性Lewis大鼠54只,隨機分為6組,分別為正常對照(Con)組(n=9)、AIA模型組(n=9)、低、中、高BHGZD干預組和甲氨蝶呤(MTX)干預組(n=6/組)。BHGZD三個給藥劑量為5.4、10.7、21.4g·kg-1,分別相當于0.5、1、2倍臨床等效劑量;甲氨喋呤給藥劑量為0.2mg·kg-1,相當于臨床等效劑量。大鼠給藥容積按照1mL/100g體重灌胃,從免疫當天開始給藥,BHGZD干預組每給藥6天,間歇1天;甲氨蝶呤每給藥3天,間歇1天;Con組和AIA模型組灌服等體積蒸餾水,各組動物給藥至造模第25天。第26天處死動物,取關(guān)節(jié)、肝腎、滑膜等組織按操作要求進行處置。1.3關(guān)節(jié)炎評價對AIA大鼠關(guān)節(jié)炎嚴重程度、疼痛閾值、關(guān)節(jié)組織病理學變化進行檢測和評價,明確該方對RA的干預效果。采用蘇木素-伊紅(HE)染色法分別對AIA大鼠肝臟組織和腎臟組織進行染色,鏡下觀察各組大鼠肝、腎受損情況,并計算肝、腎指數(shù)。2.全基因組表達譜芯片檢測與網(wǎng)絡藥理學分析的整合研究2.1全基因組表達譜芯片檢測及差異表達基因篩選采用Agilent表達譜芯片配套試劑盒(Low Input Quick Amp Labeling Kit)提取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的RNA樣本,并用RNeasy mini kit純化標記后的cRNA。采用全基因組表達譜芯片檢測技術(shù)(Agilent Whole Rat Genome Microarray 4×44K),利用R軟件中Limma包對芯片檢測原始數(shù)據(jù)進行歸一化,計算基因組間表達量差異倍數(shù)(Fold-change)及T檢驗(Student's t-test),以Fold Change≤0.5或Fold Change≥2,T-test P-value0.05為標準,篩選AIA模型組與Con組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織之間的差異表達基因,獲得AIA病相關(guān)基因集。。2.2 BHGZD化學成分庫的建立用超高速液相色譜譜飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra-fast liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry,UFLC-Q-TOF-MS/MS),對BHGZD 水液中化學成分進行鑒定;從臺灣中醫(yī)藥資料庫TCM Data base@Taiwan獲取BHGZD五中藥的化學成分信息。2.3 BHGZD所含化學成分的候選靶標預測于課題組前期建立的方法,預測BHGZDD含化學成分的候選靶標。2.4 RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析合相關(guān)數(shù)據(jù)庫收集的RA相關(guān)分子信息及AIA發(fā)病相關(guān)基因,基于BHGZD所含中藥及其相應候選靶標分子的相互作用,建立“RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標”相互作網(wǎng)絡。算每個節(jié)點的網(wǎng)絡拓撲特征值(節(jié)點連接度、節(jié)點介度和節(jié)點緊密度);篩選連接度大于所有節(jié)點連接度中位值兩倍的節(jié)點,為網(wǎng)絡中的hub節(jié)點,并進行直接相互作用絡的構(gòu)建;選取上述拓撲特征值均大于相應中位值的節(jié)點,為網(wǎng)絡中的關(guān)鍵hub節(jié)點。得上述關(guān)鍵網(wǎng)絡hub節(jié)點所參與的通路信息,通過統(tǒng)計學計算和通路富集分析,選與RA相關(guān)的通路。。3.BHGZD對預測信號軸的調(diào)控作用驗證用蛋白印跡反應(western blot,WB)檢測TLR4-c-Fos-IL2--TNF-α信號軸中TLR4(Toll-樣受體 4,Toll-like receptor 4)、c-Fos/APP1(原癌基因,Fos proto-oncogene/AP-1 transcription factor subunit)、IL2(白介素2,,interleukin 2)和TNF-α(腫瘤壞死因子-α,tumor necrosis factor-alpha)在AIA大鼠受累踝關(guān)節(jié)組織中的表達情況,并利用軟件進行據(jù)分析。結(jié)果1.RA動物模型的成功建立及BHGZD干預RA的藥效學評價AIA模型組大鼠紅腫、畸形癥狀顯著,即建模成功。BHGZD可有效緩解AIA大鼠關(guān)節(jié)炎嚴重程度、緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)組織病理學改變,并在一定劑量范圍內(nèi)(5.4g·kg-1～21.4g·kg-1)呈現(xiàn)劑量依賴性(p0.05、p0.01或p0.001)。AIA大鼠肝、腎組織HE染色結(jié)果,尚未觀察到AIA大鼠模型建立及BHGZD給藥造成的肝、腎損傷等病理變化。2.BHGZD干預RA相關(guān)“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡的分子機制預測2.1 RA發(fā)病相關(guān)基因集的篩選基于全基因組表達譜芯片檢測技術(shù),得到26個AIA模型組與Con組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織之間的差異表達基因,其中9個上調(diào)基因,17個下調(diào)基因。2.2 RA疾病相關(guān)基因的收集和整理從Drugbank和KEGG數(shù)據(jù)庫共收集到208個已知RA相關(guān)基因,與全基因組表達譜芯片檢測所得26個AIA發(fā)病相關(guān)分子,去冗余后共得234個RA相關(guān)基因。2.3 BHGZD所含化學成分庫的建立采用UFLC-Q-TOF-MS/MS分析技術(shù),基于化學標準品、色譜行為、離子碎片以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(Natural Products HR-MS/MS Spectral Library)信息共鑒定出41種化合物,其中19種化學成分是依據(jù)化學標準品比對鑒定;從臺灣中醫(yī)藥資料庫TCM Database@Taiwan收集得到的123個BHGZD所含化學成分的二級結(jié)構(gòu)。2.4 BHGZD所含化學成分的候選靶標基于BHGZD化學成分庫,通過結(jié)構(gòu)相似性和功能相似性原理,預測得到1312個候選靶標,來自桂枝、甘草、知母、石膏、粳米的預測靶標數(shù)目分別為545、701、197、424、266。其中含有53個已知干預RA的相關(guān)基因等。2.5 RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析基于BHGZD所含中藥與其對應候選靶標的相互作用,建立“RA相關(guān)分子-BHGZD候選靶標”相互作用網(wǎng)絡�；赟tring數(shù)據(jù)庫,提取上述RA相關(guān)分子和BHGZD候選靶標的相互作用信息,并用string interaction score的中位數(shù)0.65為卡值,選取大于此卡值的相互作用信息;計算得到623個具有高連接度的hub節(jié)點,計算節(jié)點連接度、節(jié)點介度和節(jié)點緊密度,獲得177個關(guān)鍵hub節(jié)點。在上述關(guān)鍵hub節(jié)點中,有39個是已知干預RA的相關(guān)基因,其中19個同時為BHGZD的候選靶標,如AGT、CCL5、CD40、CSF2、ESRI1、FOS、IFNG、IKBKB、IL110、IL1B、IL2、IL4、IL6、PPARG、PTGS2、PTK2B、TGFB11、TLR4和TNF。獲得上述關(guān)鍵網(wǎng)絡節(jié)點所參與的通路信息,通過統(tǒng)計學計算和通路富集分析,發(fā)現(xiàn)BHGZD干預RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡靶標顯著參與Toll樣受體信號通路、B細胞及T細胞受體信號通路、VEGF信號通路等RA“炎癥-免疫”失衡相關(guān)通路,還顯著富集于三條與肪酸代謝相關(guān)的通路,脂肪酸合成通路、碳水化合物消化吸收以及脂肪細胞因子信號通路。其中TLR4、c-Fos、IL2與TN F-α四個分子顯著富集于Toll樣受體信號通路和T細胞受體信號通路,且具有直接相互作用關(guān)系。3.BHGZD可抑制RA“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信號軸相關(guān)蛋白的異常高表達驗證實驗結(jié)果顯示,與Con組相比,AIA模型組的大鼠受累踝關(guān)節(jié)組織中TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α四種蛋白的表達均異常升高(均p0.001),低、中、高劑量BHGZD均可下調(diào)此四種蛋白表達水平(p0.05、p0.01或p0.001)。結(jié)論1本研究基于AIA大鼠模型,發(fā)現(xiàn)BHGZD可顯著改善AIA大鼠關(guān)節(jié)紅腫、畸變、疼痛等癥狀,明確BHGZD對RA的干預效果。2通過開展全基因組表達譜芯片檢測和網(wǎng)絡藥理學分析的整合研究,篩選出顯著參與RA“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡調(diào)節(jié)的BHGZD的關(guān)鍵網(wǎng)絡靶標,其中包括TLR4、c-Fos、IL2及TNF-α等顯著富集于Toll樣受體信號通路和T細胞受體信號通路的關(guān)鍵網(wǎng)絡靶標。3通過實驗驗證表明,BHGZD可能是通過調(diào)控“炎癥-免疫”失衡網(wǎng)絡TLR4-c-Fos-IL2-TNF-α信號軸發(fā)揮干預RA的藥效作用。4該方的關(guān)鍵網(wǎng)絡靶標還顯著富集于三條與肪酸代謝相關(guān)的通路,這可能與該方的寒藥性有關(guān)。綜上,本研究從“炎癥-免疫”網(wǎng)絡角度切入,初步揭示BHGZD干預RA的作用機制,為深入闡明該方治痹的科學內(nèi)涵提供實驗依據(jù),為后續(xù)“病-證-方”結(jié)合研究奠定良好基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

ｏｎ邋；逡逑ｉ逡逑！逡逑；逡逑ｉ逡逑Ｉ逡逑；逡逑＼逡逑；逡逑．逡逑？逡逑ｓｉｓ邋；逡逑！逡逑！逡逑｜逡逑＼逡逑！逡逑１逡逑ｉｏｎ邋；逡逑；逡逑！逡逑！逡逑ｊ逡逑ｉ逡逑：逡逑

ＡＩＡ＋ＢＨＧＺＤ邋１０．７邋ｇ？ｋｇ－＇邐ＡＩＡ＋ＢＨＧＺＤ邋２１．４邋ｇ．ｋｇ．１邐ＡＩＡ＋ＭＴＸ邋０．２邋ｍｇ．ｋｇ．１邐＇邋１逡逑圖２．１．１白虎加桂枝湯對ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)的影響逡逑３．２邋ＢＨＧＺＤ千預后可顯著改善ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎嚴重情況逡逑３．２．１邋ＢＨＧＺＤ可顯著緩解ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎嚴重程度逡逑（１）疾病嚴重程度量化評價指標逡逑關(guān)節(jié)炎臨床積分、疾病發(fā)病率、首次發(fā)病時間及受累肢體累計率是最為直觀地反映逡逑疾病嚴重程度的量化評價指標。實驗數(shù)據(jù)顯示，低、中、高不同劑量ＢＨＧＺＤ干預后呈逡逑劑量依賴性改善ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎的嚴重程度（圖２．１．２），表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎臨床積分、關(guān)節(jié)逡逑炎發(fā)病率及受累肢體累計率的下降，首次發(fā)病時間的延長。數(shù)據(jù)表明，ＡＩＡ模型組的關(guān)逡逑節(jié)臨床積分最高為３４分，發(fā)病率為９４％，首次發(fā)病時間為第１１天，受累肢體累計率為逡逑７３％邋（附錄表１－４）。逡逑

圖２．１．２白虎加桂枝湯對ＡＩＡ大鼠關(guān)節(jié)炎嚴重程度的影響逡逑（Ａ）各組大鼠關(guān)節(jié)臨床積分：（Ｂ）各組大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率；（Ｃ）各組大鼠關(guān)節(jié)炎首次發(fā)病時間；（Ｄ）各組大鼠受逡逑累肢體累計率（數(shù)據(jù)為均數(shù)±標準差農(nóng)示與正常對照組相比，ｐ＜０．０１，＿？＜０．００丨：“＊”，“＊＊”，“＊＊＊”及逡逑示與邋ＡＩＡ邋模型組相比，／７＜０．０５，ｐ＜０．０１，ｐ＜０．００１邋）逡逑①關(guān)節(jié)臨床積分：ＡＩＡ模型組大鼠的關(guān)節(jié)臨床積分為３４，低、中、高劑量ＢＨＧＺＤ干預逡逑后均可顯著降低關(guān)節(jié)臨床積分（＾＜０．０５、產(chǎn)０．０１或ｐ＜０．００１），其中高劑量ＢＨＧＺＤ的效逡逑果最為顯著（圖２．１．２八，／？＜０．００１）；逡逑②關(guān)節(jié)炎發(fā)病率：ＡＩＡ模型組大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達９４％，中、高劑量ＢＨＧＺＤ干預后逡逑關(guān)節(jié)炎發(fā)病率均顯著降低（均ｐ＜0．0５），分別為７８％、６７％，低劑量ＢＨＧＺＤ療效稍差逡逑（圖邋２．１．２Ｂ）；逡逑③首次發(fā)病時間：ＡＩＡ模型組大鼠關(guān)節(jié)炎首次發(fā)病時間為造模第１１天，低、中、高劑逡逑量ＢＨＧＺＤ干預后可延長關(guān)節(jié)炎首次發(fā)病時間（ｐ＜０．０５或／７＜０．００１），至造模第１２天，逡逑其中高劑量藥效最佳，效果與陽性藥ＭＴＸ相似（圖２．１．２Ｃ）；逡逑④受累肢體累計率：ＡＩＡ模型組大鼠的受累肢體累計率為７３％，低、中、高劑量ＢＨＧＺＤ逡逑

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本文編號：2801651