【摘要】：肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著人類健康。臨床治療肺癌的方法有放射治療、化學(xué)治療、介入治療、基因治療等,但肺癌患者的預(yù)后仍然很差,中晚期患者5年生存率僅為15%。與腫瘤發(fā)病后治療相比,腫瘤預(yù)防無疑是降低腫瘤死亡率最好的辦法。之前腫瘤的治療主要是放在腫瘤自身,近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展同樣至關(guān)重要,腫瘤微環(huán)境為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供物質(zhì)和能量。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生過程中的一個重要特征,其同樣受腫瘤微環(huán)境的調(diào)控。烏頭堿具有強心、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用,臨床上廣泛用于關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)寒濕痹、坐骨神經(jīng)痛等,其鎮(zhèn)痛作用強大且不容易耐受。近年來,烏頭堿在腫瘤治療方面的報道也越來越多,一般認為烏頭堿通過促進腫瘤細胞凋亡或者增強放化療效果作用于腫瘤,而在預(yù)防與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境方面少有報道。本研究的目的是觀察細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化對烏頭堿降低肺癌惡性的貢獻,以期為肺癌防治提供新思路。本研究首先對烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌模型進行優(yōu)化,通過比較肺癌發(fā)生率、穩(wěn)定性和平均腫瘤個數(shù),評價造模3次和10次對小鼠肺癌發(fā)生率的影響,并比較昆明小鼠、BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠三種品系對烏拉坦誘導(dǎo)肺癌的敏感性;免疫組化法檢測小鼠肺組織TTF-1,酶聯(lián)免疫試劑盒法檢測小鼠血漿中CEA含量,確定小鼠肺癌發(fā)生。接著觀察烏頭堿對烏拉坦小鼠肺癌的影響,比較小鼠體重、自主活動、肺臟指數(shù)和腫瘤結(jié)節(jié)數(shù),免疫熒光法檢測小鼠肺組織上皮間充質(zhì)相關(guān)蛋白以及小鼠肺組織中干性標(biāo)志蛋白的表達。為了觀察烏頭堿對肺癌細胞的影響,我們用MTT法篩選出對LLC細胞10%抑制率的烏頭堿濃度,用其處理LLC細胞,兩周后,PCNA免疫熒光法檢測LLC細胞的惡性增殖能力,Transwell檢測侵襲能力,細胞劃痕檢測遷移能力,軟瓊脂克隆法、細胞成球法檢測LLC細胞自我更新能力,流式細胞術(shù)檢測腫瘤干細胞標(biāo)志物Oct-4、NANOG、PCNA的表達量,Western blot檢測細胞中上皮間充質(zhì)相關(guān)蛋白和EGF、FGF、HGF、OSM的表達;并在加入烏頭堿處理的細胞培養(yǎng)基中分別加入EGF、FGF、HGF、OSM抗體,觀察其對烏頭堿對LLC細胞惡性作用的影響。最后,我們改變肺癌細胞培養(yǎng)基中的細胞因子水平,加入EGF、FGF、HGF、OSM模擬烏頭堿調(diào)控LLC細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的微環(huán)境,觀察其與烏頭堿是否有相似作用。實驗結(jié)果表明,腹腔注射烏拉坦600mg/Kg,每周1次,造模10次能夠建立發(fā)生率達到100%、死亡率低的小鼠肺癌模型,昆明小鼠是最敏感造模小鼠。在小鼠肺癌發(fā)生過程中,肺組織TTF-1表達增加,血漿中CEA含量增加。烏頭堿治療烏拉坦小鼠肺癌實驗結(jié)果表明,烏頭堿能夠增加肺癌小鼠體重和自主活動,降低肺癌小鼠肺臟指數(shù),減少肺癌小鼠肺部結(jié)節(jié)數(shù),增加肺癌小鼠E-Cadherin和Cytokeratin18,降低N-Cadherin和Vimentin,降低Oct-4、NANOG、PCNA的表達量,降低肺癌細胞的惡性。烏頭堿處理LLC細胞結(jié)果顯示,烏頭堿在不影響LLC細胞正常增殖的情況下,能夠降低LLC細胞的惡性增殖、侵襲、遷移能力,減少軟瓊脂克隆數(shù)和細胞成球數(shù),降低Oct-4、NANOG、PCNA表達,增加E-Cadherin和Cytokeratin18,降低N-Cadherin和Vimentin,降低LLC細胞惡性,并且增加LLC細胞中EGF、FGF、HGF、OSM表達;而加入EGF、FGF、HGF、OSM中任意一種細胞因子抗體,都會提高LLC細胞的惡性增殖和侵襲能力,上調(diào)肺癌細胞上皮間充質(zhì)過程,增加干性相關(guān)蛋白的表達,明顯減弱烏頭堿降低LLC細胞惡性的作用。最后我們發(fā)現(xiàn),在LLC細胞培養(yǎng)基中加入EGF、FGF、HGF、OSM四種細胞因子能夠改變LLC細胞形態(tài),降低LLC細胞的惡性增殖、侵襲、遷移能力,減少軟瓊脂克隆數(shù)和細胞成球數(shù),增加E-Cadherin和Cytokeratin18,降低N-Cadherin和Vimentin,降低Oct-4、NANOG、PCNA表達量,能夠起到和烏頭堿相似的作用。綜上所述,腹腔注射烏拉坦600mg/Kg,每周1次,造模10次是小鼠肺癌模型的最佳造模方法。烏頭堿通過改變細胞因子水平,干預(yù)肺癌發(fā)生過程中EMT微環(huán)境,降低肺癌的惡性,阻止肺癌發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

1 2圖 2-1 小鼠肺重量和肺部結(jié)節(jié)數(shù)（X± s，n=30）2.4.2 各組小鼠死亡率和成瘤率統(tǒng)計各組小鼠死亡率和成瘤率發(fā)現(xiàn)，3 次注射烏拉坦，昆明小鼠、BALB/C 小鼠、C57/BL 小鼠的死亡率分別為 0，0，5.1%，成瘤率分別為 40.4%，20.4%，9.3%。10 次注射烏拉坦，昆明小鼠、BALB/C 小鼠、C57/BL 小鼠的死亡率分別為 26.1%，29.7%，35.0%，成瘤率均達到 100%。（表 2-1，圖 2-2）

圖 2-2 各組小鼠肺癌發(fā)生率E 染色結(jié)果結(jié)果顯示，3 次注射的昆明小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的瘤區(qū)，腺瘤細胞浸潤，細胞核密集并且染色比較深；3 次注射的 BALB/C集的瘤區(qū)，但是瘤區(qū)比較小，能看到腺圈；3 次注射的 C57BL/被腫瘤細胞浸潤，并且有炎癥滲出。10 次注射的各品系小鼠均有瘤區(qū)中間區(qū)域甚至出現(xiàn)壞死，腺圈幾乎完全消失。（圖 2-3）

圖 2-3 小鼠肺組織 HE 染色2.4.4 免疫組化法檢測小鼠肺組織 TTF-1 結(jié)果比較如圖 2-4 所示，DAB 染色后，組織上出現(xiàn)的棕黃色、黃色、淡黃色為陽性色。由圖可以看出，各品系正常小鼠陽性色很淺甚至無陽性色，腹腔注射烏拉坦的各種品系小鼠均出現(xiàn)不同程度的陽性色；同品系小鼠相比，10 次注射烏拉坦的小鼠均比 3 次注射烏拉坦小鼠 TTF-1 表達量高，其中 10 次注射烏拉坦的昆明小鼠 TTF-1 表達量最高。

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本文編號：2801476