【摘要】：糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要原因。既往研究多認(rèn)為DN蛋白尿的出現(xiàn)與腎小球基底膜(GBM)增厚和系膜增生有關(guān),但近年病理學(xué)研究證實(shí)DN是一種足細(xì)胞病,足細(xì)胞損傷貫穿了DN的發(fā)生和發(fā)展全過(guò)程,要控制DN蛋白尿的關(guān)鍵在于穩(wěn)定足細(xì)胞形態(tài)與功能。研究目的:本研究主要關(guān)注于高糖狀態(tài)下足細(xì)胞的凋亡和自噬情況,探討高糖對(duì)足細(xì)胞損傷和自噬的影響及固本化瘀通絡(luò)合劑對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用,以期為DN提供新的防治靶點(diǎn)。研究方法:選用條件性永生化小鼠足細(xì)胞株(Mouse podocyte,MPC5)作為研究對(duì)象,運(yùn)用固本化瘀通絡(luò)合劑含藥血清作用于足細(xì)胞,使用正常糖、高糖為干預(yù)措施,采用流式細(xì)胞術(shù)、mRFP-GFP-LC3熒光雙標(biāo)腺病毒、免疫熒光、Western Blot、RT-PCR等為檢測(cè)技術(shù),進(jìn)行兩部分實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一:高糖對(duì)足細(xì)胞損傷的影響及固本化瘀通絡(luò)合劑的保護(hù)作用分別使用正常血糖(5mmol/L D-葡萄糖)+空白血清、高糖(30mmol/L D-葡萄糖)+空白血清和高糖+含藥血清干預(yù)培養(yǎng)MPC5 24、48、72h后,通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡分析高糖對(duì)足細(xì)胞損傷的影響及固本化瘀通絡(luò)合劑對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)二:高糖對(duì)足細(xì)胞自噬的影響及固本化瘀通絡(luò)合劑對(duì)自噬的調(diào)控作用分別使用正常血糖(5mmol/L D-葡萄糖)+空白血清、高糖(30mmol/L D-葡萄糖)+空白血清和高糖+含藥血清干預(yù)培養(yǎng)MPC5細(xì)胞株24、48、72h后,采用mRFP-GFP-LC3熒光雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染和Western Blot檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、免疫熒光結(jié)合Western Blot檢測(cè)自噬潮(autophagicflux)標(biāo)志物--p62/SQSTM1、Western Blot檢測(cè)足細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(Beclin1)的表達(dá)、RT-PCR檢測(cè)足細(xì)胞自噬相關(guān)基因(LC3、p62和Beclin1)的表達(dá);以此來(lái)分析高糖對(duì)腎小球足細(xì)胞自噬平衡的干預(yù)效應(yīng)以及固本化瘀通絡(luò)合劑對(duì)足細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。研究結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷且誘導(dǎo)凋亡增加;固本化瘀通絡(luò)合劑對(duì)足細(xì)胞起保護(hù)作用,減少足細(xì)胞凋亡發(fā)生。實(shí)驗(yàn)二:1.1.mRFP-GFP-LC3熒光雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染:足細(xì)胞的自噬體和自噬溶酶體在高糖刺激下減少;而固本化瘀通絡(luò)合劑則可增加高糖環(huán)境下這兩者的數(shù)量。2.免疫熒光檢測(cè)p62水平:高糖導(dǎo)致P62堆積過(guò)多,固本化瘀通絡(luò)合劑可減少P62的堆積。3.Western Blot和RT-PCR檢測(cè)LC3、P62和Beclin1的蛋白及基因表達(dá)水平:高糖環(huán)境下足細(xì)胞自噬被抑制,自噬降解不暢,表現(xiàn)為L(zhǎng)C3、Beclin1的表達(dá)減少,P62堆積;固本化瘀通絡(luò)合劑可改善高糖引起的足細(xì)胞自噬抑制狀態(tài)且自噬流通暢。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)一:高糖可引起足細(xì)胞損傷,增加足細(xì)胞凋亡;固本化瘀通絡(luò)合劑可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷,減少足細(xì)胞凋亡,對(duì)足細(xì)胞有一定保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)二:1.高糖可抑制足細(xì)胞自噬,固本化瘀通絡(luò)合劑對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬水平可相對(duì)提高。2.固本化瘀通絡(luò)合劑或是通過(guò)作用于Beclin1調(diào)控足細(xì)胞自噬水平以減少細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2796536