【摘要】：心肌肥大(cardiac hypertrophy)是眾多心血管疾病的一個(gè)共同特征,高血壓、心瓣膜病和冠心病等多種疾病的發(fā)展過(guò)程中常常伴有心肌肥大。盡管它有助于代償性保持心功能,但長(zhǎng)期的心肌肥大最終會(huì)導(dǎo)致心衰。心肌細(xì)胞作為一種終末分化細(xì)胞,出生后不久就不再具有分裂能力。當(dāng)心臟受到損傷性刺激時(shí),細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白合成增加但不能完成分裂,最終導(dǎo)致細(xì)胞肥大。防治與逆轉(zhuǎn)心肌肥大已成為心血管疾病治療的主要目標(biāo)。p53作為一種抑癌基因,是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子,正常情況下維持于較低水平,激活時(shí)能誘導(dǎo)其下游基因細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CDKI)p21的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。雷公藤甲素(triptolide,TP)是從雷公藤中提取出的一種環(huán)氧二萜類內(nèi)酯型化合物,具有多種生物學(xué)活性,常用于治療炎癥和自身性免疫疾病,如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎和哮喘等。雷公藤甲素能否通過(guò)影響p53-p21信號(hào)通路從而抑制心肌細(xì)胞肥大尚不明確。本研究旨在探討p53-p21信號(hào)通路在心肌肥大中的作用機(jī)制,及雷公藤甲素對(duì)心肌細(xì)胞p53-p21信號(hào)通路的影響。方法:1. 分離乳鼠心肌細(xì)胞,在不含血清的培養(yǎng)基里恒溫孵育24h,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行干預(yù),按MOI=10感染p21或p53腺病毒12h,或者加入p21/p53 si RNA孵育5-7h后,更換為新鮮的低糖DMEM恢復(fù)24h。加入Ang II 1μmol/L與TP 1、3、10μg/L,處理24小時(shí)。熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),測(cè)定細(xì)胞面積。分別采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)p21、p53和β-MHC m RNA及蛋白表達(dá)變化情況。免疫熒光染色α-actinin和p21,激光共聚焦顯微鏡觀察p21細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。2.健康SPF級(jí)雄性C57小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、雷公藤甲素(0.3、1、3或10μg·kg~(-1)·d~(-1))處理組,共6組,每組5只。分別給予生理鹽水、異丙腎上腺素滲透壓微量泵灌注(40 mg·kg~(-1)·d~(-1),sc,14d)和異丙腎上腺素灌注+TP(0.3、1、3或10μg·kg~-~1·d~(-1),ip,qd)。另一批小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、p53腺病毒組、p53抑制劑組、雷公藤甲素組(10μg·kg~(-1)·d~(-1))、p53腺病毒+TP組和p53抑制劑+TP組,模型組處理同前,p53腺病毒組尾靜脈注射2×10~(7 )TU的p53腺病毒,p53抑制劑組注射pifithrin-α(2mg·kg~(-1)·d~(-1),ip,qd)。3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,密切觀察小鼠一般狀況及死亡情況。末次給藥后,稱量體重,測(cè)定小鼠心臟指數(shù)。采用麥胚凝集素染色觀察計(jì)算細(xì)胞平均面積,HE和Masson染色觀察心肌組織病理變化與膠原沉積情況。4.分別采用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)心肌組織中p21、p53、β-MHC和PCNA m RNA及蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1. Ang II處理后心肌細(xì)胞面積明顯增加,β-MHC、p53、p21 m RNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高;1~10μg/L的TP能劑量依賴性降低細(xì)胞面積以及上述基因的表達(dá)。2. p21或p53腺病毒轉(zhuǎn)染均能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞面積明顯增加,并進(jìn)一步加劇Ang II所引起的細(xì)胞肥大及β-MHC、p53、p21 m RNA與蛋白表達(dá)上升;而p21和p53 si RNA可以部分削弱Ang II引起的以上變化。3.正常情況下p21于細(xì)胞漿內(nèi)低表達(dá),Ang II和p53-Ad能上調(diào)p21的表達(dá)并且使p21向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,而p53 si RNA則下調(diào)p21的表達(dá)。4.TP能有效抑制Ang II引起的細(xì)胞面積增加及β-MHC、p53、p21 m RNA與蛋白表達(dá)上升,p21和p53腺病毒會(huì)部分削弱TP對(duì)細(xì)胞肥大的抑制作用,而p21和p53si RNA對(duì)TP起到協(xié)同作用。5.ISO處理模型組小鼠心臟指數(shù)明顯要高于對(duì)照組,纖維間質(zhì)和血管周圍出現(xiàn)膠原沉積,心肌纖維斷裂,心肌細(xì)胞面積明顯增大,β-MHC、p53、p21和PCNA m RNA和蛋白表達(dá)增加;而在給予了0.3~10μg·kg~(-1)·d~(-1)的TP后,心臟指數(shù)較ISO組呈不同程度的降低,心肌細(xì)胞面積減小,纖維化得到有效抑制;高劑量組β-MHC、p21和PCNA m RNA顯著降低,1~10μg·kg~(-1)·d~(-1)的TP能顯著抑制β-MHC、p53、p21和PCNA蛋白表達(dá)。6.p53腺病毒轉(zhuǎn)染會(huì)引起小鼠心臟指數(shù)升高,心肌細(xì)胞面積同對(duì)照組相比顯著增加;同時(shí),p53腺病毒處理明顯降低TP抑制纖維化和下調(diào)p53 m RNA和蛋白的作用。結(jié)論:1.體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞以及小鼠心肌肥大過(guò)程中均伴隨著p53、p21的表達(dá)上升。2. 雷公藤甲素能下調(diào)心肌細(xì)胞p53和p21的表達(dá),顯著抑制Ang II所導(dǎo)致的原代心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)和ISO處理誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大。3.0.3~10μg/kg的雷公藤甲素能呈劑量依賴性減輕心肌損傷,抑制心肌纖維化。4.p53的表達(dá)升高會(huì)引起p21的升高和PCNA的下調(diào),同時(shí)p21對(duì)p53的表達(dá)具有有限的正反饋調(diào)節(jié)作用。5.TP對(duì)心肌肥大的抑制作用可能和降低p53-p21信號(hào)通路的活性,減少細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

(9)結(jié)果分析顯影后，使用 Image Lab 軟件進(jìn)行積分析。2.1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示，采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行單因素方以 p<0.05 認(rèn)為具有顯著性差異。 結(jié) 果2.2.1 雷公藤甲素對(duì)原代心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的影響2.2.1.1 雷公藤甲素對(duì) AngII 處理后的原代心肌細(xì)胞面積的影響經(jīng) AngII 刺激 24h 后原代心肌細(xì)胞面積明顯增加，與對(duì)照組相比，其平均面 115% (p<0.01)。而在加入了 1、3、10 μg/L 的 TP 后，與模型組相比，細(xì)胞均顯著減小(p<0.01) (見(jiàn)圖 1~2)。

圖 2. 雷公藤甲素對(duì) Ang II 處理后的原代心肌細(xì)胞面積的影響(n=50， x±s)與對(duì)照組比較，**p<0.01；與 Ang II 處理組相比，##p<0.01.2.1.2 雷公藤甲素對(duì) AngII 處理后的原代心肌細(xì)胞 β-MHC、p53、p21 m達(dá)的影響eal-time PCR 反應(yīng)后經(jīng)內(nèi)參 β-actin 與對(duì)照組 mRNA 校正，模型組中 β21 mRNA 表達(dá)均明顯上升(p<0.01)，高、中、低劑量 TP 組的 β-MHC、p 的表達(dá)較模型組都呈顯著下降(p<0.01) (見(jiàn)圖 3)。estern blot 法檢測(cè)原代心肌細(xì)胞中 β-MHC、p53、p21 的蛋白質(zhì)的表達(dá)，-actin 相比校正后，模型組中的 β-MHC、p53、p21 的蛋白表達(dá)較對(duì)照組6%、55%、52%(p<0.01)。在高、中、低 TP 劑量組 β-MHC、p53、p21 的不同程度的降低，與 AngII 處理組相比，3.0，10.0 μg/LTP 組 β-MHC 表了 36%和 43%(p<0.01)，10.0 μg/LTP 組 p53 表達(dá)量降低了 59% (p<0.01

圖 3. 雷公藤甲素對(duì) AngII 處理后的原代心肌細(xì)胞 β-MHC、p53、p21 mRNA 表達(dá)的影響 (n=4， x±s)與對(duì)照組比較，**p<0.01；與 AngII 處理組相比，##p<0.01圖 4. 雷公藤甲素對(duì) AngII 處理后的原代心肌細(xì)胞 β-MHC、p53 和 p21 蛋白表達(dá)的影響

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 方勇;藍(lán)文賢;孔令義;;p53蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)展[J];生命的化學(xué);2015年04期

本文編號(hào)：2796465