【摘要】：姜黃(Curcuma longa L.)、郁金(Curcuma rcenyujin Y,H.Chenet C.Ling)和莪術(shù)(Curcuma zedoaria(Christm.)Rosc.)均為姜科植物。中醫(yī)認(rèn)為姜黃能行氣、散風(fēng)活血、通經(jīng)止痛;郁金能活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃;莪術(shù)具有行氣解郁、破瘀、止痛的功效。三者的藥理活性集中表現(xiàn)為抗腫瘤、抗真菌、抗炎、降血脂、利膽、保肝和抗血栓形成等。姜黃素是從姜科植物姜黃、郁金、莪術(shù)根莖中提取得到的一種植物多酚,研究表明,其具有抗腫瘤、降血脂、抗?jié)�、抗炎、抗菌、利膽等藥理作用。可�?姜黃素是姜黃、郁金、莪術(shù)中發(fā)揮藥理作用最重要的藥物活性成分(Active pharmaceutical ingredients,API),其最顯著的優(yōu)勢是無明顯的毒副作用。盡管姜黃素對人的安全劑量高達(dá)12 g/天,但是姜黃素極低的水溶性和生物利用度使其應(yīng)用受到限制。藥物共晶和共無定形是API與生物相容性小分子前體(Co-amorphous former,CAF;Co-crystal former,CCF)(而非高分子聚合物)以氫鍵、范德華力等非共價(jià)作用力結(jié)合而成的超分子體系,其不改變API分子本身的化學(xué)結(jié)構(gòu),使其保持原有藥理活性,但能改善API的溶解度、溶出速率、生物利用度等性質(zhì),故在改善API理化性質(zhì)的研究領(lǐng)域備受關(guān)注。本論文以中藥單體姜黃素為模型分子篩選共晶等超分子復(fù)合物,以其抗腫瘤作用為目標(biāo),探索姜黃素與CCF之間不同作用方式對其性質(zhì)的影響,包括溶解度、溶出速率、與BSA的結(jié)合規(guī)律、體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)、體外細(xì)胞毒性。該研究將現(xiàn)代晶體工程學(xué)的方法和理論應(yīng)用到對傳統(tǒng)中藥有效單體成分的不良理化性質(zhì)改善的研究中,為將姜黃素共晶等超分子開發(fā)為具有明確抗腫瘤機(jī)制的復(fù)合物體系奠定理論基礎(chǔ)。第一部分基于姜黃素的超分子復(fù)合物的篩選及理化性質(zhì)評價(jià)目的:以姜黃素為模型API,篩選基于姜黃素的共晶或共無定形超分子復(fù)合物,改善姜黃素的溶解度、溶出速率等理化性質(zhì)。方法:以姜黃素為API,以小分子有機(jī)酸、氨基酸、酰胺類和哌嗪類等化合物以及具有藥理活性的其它API(Ⅱ)為CCF,采用溶劑輔助研磨法篩選共晶或共無定形超分子;應(yīng)用X-射線粉末衍射(Powder x-ray diffraction,PXRD)、差示掃描量熱(Differential scanning calorimeter,DSC)、熱重(Thermogravimetric analysis,TGA)、場發(fā)射掃描電鏡(Field emission scanning electron microcopy,FESEM)、紅外光譜(Infrared radiation,IR)、固態(tài)核磁(Solid state nuclear magnetic resonance,ssNMR)等技術(shù)對超分子復(fù)合物進(jìn)行表征;并分別采用飽和溶解度法和槳法測定復(fù)合物的溶解度和體外溶出速率。結(jié)果:聯(lián)合PXRD和DSC分析,確定篩選出API-CAF共無定形一個(gè):姜黃素-哌嗪共無定形;API-CCF共晶兩個(gè):姜黃素-哌嗪和姜黃素-異煙堿共晶;API(I)-API(Ⅱ)共晶一個(gè):姜黃素-沒食子酸共晶。IR和ssNMR分析結(jié)果表明,姜黃素-哌嗪和姜黃素-異煙堿共晶超分子復(fù)合物中的氫鍵類型為C=O???H-N,其中C=O來源于姜黃素,N-H來源于哌嗪和異煙堿;而姜黃素-沒食子酸共晶中則存在源于姜黃素的酚O-H和沒食子酸C=O的C=O???H-O氫鍵。體外溶出結(jié)果表明,共晶的溶出速率與姜黃素單體相比有較大提高(P0.05)。結(jié)論:姜黃素共晶復(fù)合物能有效的改善其體外的溶解度、溶出速率,姜黃素共晶超分子復(fù)合物的篩選在提高其體外理化性質(zhì)方面有較大潛力。第二部分熒光光譜法和DFT理論計(jì)算研究姜黃素超分子復(fù)合物與牛血清白蛋白的相互作用目的:在生理p H條件下,對姜黃素單體及其共晶超分子復(fù)合物與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)的作用機(jī)制進(jìn)行研究,從分子水平探索姜黃素形成共晶超分子后與姜黃素單體相比,其與BSA的結(jié)合規(guī)律發(fā)生的變化及原因,為深入研究基于姜黃素的超分子復(fù)合物在體內(nèi)的儲(chǔ)存、運(yùn)輸、作用機(jī)理提供參考。方法:采用熒光光譜技術(shù),輔助紫外光譜和密度泛函理論(Density functional theory,DFT)模擬計(jì)算,研究人體生理pH條件下姜黃素與BSA和姜黃素-CCF超分子復(fù)合物與BSA的相互作用,通過繪制298、310和315 K溫度下Stern-Volmer和修正的Stern-Volmer曲線并進(jìn)行相關(guān)計(jì)算,確定各自的熒光猝滅機(jī)理,測定結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)果:姜黃素、姜黃素-哌嗪和姜黃素-異煙堿共晶隨著溫度的升高,其與BSA的結(jié)合常數(shù)K_b減小,說明猝滅過程為靜態(tài)猝滅;而姜黃素-沒食子酸共晶的K_b值隨溫度的升高逐漸增大,但其猝滅常數(shù)隨溫度的升高呈降低趨勢,推測猝滅過程為動(dòng)態(tài)猝滅伴隨靜態(tài)猝滅;熱力學(xué)函數(shù)的計(jì)算表明,姜黃素、姜黃素-哌嗪和姜黃素-異煙堿共晶與BSA結(jié)合依靠氫鍵和/或范德華力,而姜黃素-沒食子酸與BSA的結(jié)合過程中,疏水作用力起主要作用;通過比較姜黃素及其復(fù)合物與BSA的K_b可知,CCF的引入影響了姜黃素與BSA的結(jié)合。DFT計(jì)算結(jié)果顯示,與色氨酸-(姜黃素)相比,色氨酸-(姜黃素-哌嗪)復(fù)合物中氫鍵變得更弱,姜黃素-哌嗪超分子與BSA結(jié)合能(-17.9 kJ·mol~(-1))比姜黃素(-26.1 kJ·mol~(-1))弱,此結(jié)果與熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論:基于姜黃素的API-CCF超分子的形成可能改變姜黃素與BSA的結(jié)合機(jī)制及結(jié)合力,從而對其體內(nèi)的運(yùn)輸產(chǎn)生影響,CCF不同,對結(jié)合的程度和方式均有影響。此研究從分子水平上模擬藥物共晶在體內(nèi)的運(yùn)輸過程,對于闡明藥物共晶的作用機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)以及生物大分子與藥物小分子的相互作用的化學(xué)本質(zhì)具有重要意義。第三部分姜黃素及其復(fù)合物體外細(xì)胞毒性評價(jià)及UPLC-MS/MS法測定大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)目的:建立姜黃素及其復(fù)合物的體內(nèi)濃度的UPLC-MS/MS測定方法,對姜黃素及其復(fù)合物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評價(jià);以其抗腫瘤活性為研究對象,評價(jià)超分子復(fù)合物的抗腫瘤特性,從而建立基于姜黃素超分子復(fù)合物的抗腫瘤模型。方法:采用UPLC-MS/MS法測定血漿中姜黃素的濃度,對姜黃素和共晶復(fù)合物進(jìn)行大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。通過MTT法,對姜黃素及其復(fù)合物作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)、肺癌細(xì)胞(A549)和肝癌細(xì)胞(Hepg)的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果:與姜黃素單體相比,共晶復(fù)合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)C_(max)、T_(max)、AUC_(0-t)以及AUC_(0-∞)均有顯著性改善(P0.05),其中C_(max)增加約30倍,T_(max)縮短約6倍,生物利用度提高超過6倍。姜黃素與沒食子酸形成共晶后,共晶中沒食子酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)C_(max)、T_(max)、AUC_(0-t)以及AUC_(0-∞)與沒食子酸單體相比有所降低,但結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)性差異。由MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,姜黃素-哌嗪和姜黃素-異煙堿共晶對HT-29、A549和Hepg細(xì)胞的抑制率均大于姜黃素,但結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)性差異。姜黃素-沒食子酸共晶對A549細(xì)胞的抑制率在高濃度時(shí)呈現(xiàn)高于姜黃素的趨勢(結(jié)果無顯著性差異),而對另外兩種細(xì)胞的抑制率較姜黃素低。結(jié)論:姜黃素共晶超分子的篩選在提高其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)C_(max)、T_(max)和生物利用度方面有較大應(yīng)用潛力;姜黃素超分子的癌細(xì)胞抑制率隨CCF種類的不同、細(xì)胞種類的不同而顯示不同的規(guī)律。中藥單體作用機(jī)制的復(fù)雜性和多靶點(diǎn)性使得其在不同細(xì)胞中不同作用機(jī)制的研究存在難度,本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論為這一研究提供了思路,也為基于姜黃素超分子體系抗腫瘤模型尤其是姜黃素-API(Ⅱ)復(fù)合物的進(jìn)一步研究指明了方向。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R284
【圖文】：

圖 1 姜黃素及 CCF 分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of CUR and CCFs圖 2 姜黃素-哌嗪共無定形體系的 PXRD 譜圖

35圖 2 姜黃素-哌嗪共無定形體系的 PXRD 譜圖Fig.2 PXRD patterns of the CUR-piperazine systemUR; (b) Piperazine; (c) CUR/piperazine 1:1; (d) CUR/piperng for 30 min; (e) CUR/piperazine 2:1; (f) CUR/piperazine 1for 60 min

圖 3 姜黃素-哌嗪共晶體系的 PXRD 譜圖 PXRD patterns of the CUR-piperazine system (*: peaks for crystalloid complex)R; (b) Piperazine; (c) CUR/piperazine 1:2; (d) CUR/piperaziCUR/piperazine 2:1

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5 杜艷霞;李s

本文編號(hào)：2796431