發(fā)布時間：2020-08-18 11:58

【摘要】：目的:研究天麻對A53Tα-突觸核蛋白(α-synuclein)轉(zhuǎn)基因帕金森小鼠的保護作用,并從基因轉(zhuǎn)錄組層面探索天麻發(fā)揮神經(jīng)保護作用及其改善帕金森病(Parkinson’s disease,PD)癥狀的分子機制。方法:1.采用A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠為實驗動物,進行小鼠擴增繁殖,通過鼠尾基因型鑒定試驗篩選轉(zhuǎn)基因PD陽性小鼠,為后續(xù)實驗做準備。2.采用4月齡A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠,設(shè)置空白組、模型組、陽性組、天麻高(14.4 g·kg~(-1))、中(7.2 g·kg~(-1))、低劑量組(0.72 g·kg~(-1)),連續(xù)灌胃給藥4周,對小鼠進行爬桿行為學(xué)檢測、中腦黑質(zhì)組織蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、神經(jīng)元細胞計數(shù)。3.通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)構(gòu)建空白組與模型組、模型組與天麻組小鼠中腦黑質(zhì)組織的轉(zhuǎn)錄組文庫,篩選差異表達基因,利用GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行功能注釋和富集分析,綜合分析篩選出天麻保護轉(zhuǎn)基因PD小鼠神經(jīng)元的關(guān)鍵基因及代謝通路,利用qRT-PCR技術(shù)驗證候選基因c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3,NPY,RASGRP1,DRD3的表達豐度。結(jié)果:1.繁殖共獲得140只離乳小鼠,80雄60雌,經(jīng)基因型鑒定轉(zhuǎn)基因PD陽性小鼠共74只,其中42雄32雌。2.爬桿行為學(xué)結(jié)果顯示,與空白組相比模型組、陽性組、天麻高、中、低劑量組得分總數(shù)差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);天麻高、中、低劑量組得分總數(shù)均高于模型組且低于空白組,其中天麻中劑量組分數(shù)最接近于陽性組,效果最為明顯,但與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.HE染色及神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果顯示與空白組相比模型組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且形態(tài)上可觀察到模型組部分神經(jīng)胞體深染、膠質(zhì)細胞增生,出現(xiàn)帕金森病癥;天麻中劑量組與模型組神經(jīng)元計數(shù)比較差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且天麻中劑量神經(jīng)元數(shù)量接近陽性組,形態(tài)上觀察到天麻中劑量組殘存的黑質(zhì)神經(jīng)元較多,細長、深染的神經(jīng)元的數(shù)量較少,而天麻高、低劑量組黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量較少。4.經(jīng)爬桿行為學(xué)試驗、HE染色及神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果表明,天麻中劑量(7.2g·kg~(-1))為轉(zhuǎn)基因PD小鼠的最適給藥劑量。5.轉(zhuǎn)錄測序共獲得74.34 Gb Clean Data,各樣品Clean Data均達到7.04 Gb,Q30堿基百分比在85.92%及以上,各樣品與參考基因的比對效率從79.70%到86.35%不等,比對效率較高。6.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明,空白組比對模型組共篩選出788個差異基因,其中369個基因表達上調(diào),419個差異基因表達下調(diào),差異基因功能注釋后分布于215條通路;模型組比對天麻組顯示共篩選出466個差異基因,其中292個基因表達上調(diào),174個基因表達下調(diào),差異基因功能注釋后分布于177條通路,經(jīng)GO、KEGG共同富集分析顯示模型組中明顯激活的為神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ca~(2+)信號通路、Ras(大鼠肉瘤原癌基因)通路,與模型組比較關(guān)鍵基因c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3在天麻組中表達下調(diào),而NPY,RASGRP1,DRD3在天麻組中表達上調(diào),最后經(jīng)qRT-PCR試驗得以驗證。結(jié)論:1.A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠可較好的模擬帕金森的發(fā)病進展,作為PD模型動物應(yīng)用于研究中較為穩(wěn)定可靠。2.天麻水煎液可改善A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠的活動能力及中腦黑質(zhì)神經(jīng)元病變,特別是天麻中劑量組(7.2 g·kg~(-1))效果較為明顯。3.本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對未給予天麻、給予天麻治療A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠及空白正常小鼠的中腦黑質(zhì)組織進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,結(jié)果表明PD發(fā)病與神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ca~(2+)信號通路、Ras等通路的激活相關(guān),天麻發(fā)揮PD保護作用可能與下調(diào)c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3等調(diào)亡相關(guān)基因,上調(diào)NPY,RASGRP1,DRD3等神經(jīng)營養(yǎng)因子及遞質(zhì)相關(guān)基因有關(guān),6個候選基因在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ras通路上富集較為顯著,可能為天麻發(fā)揮神經(jīng)保護作用,治療PD的靶基因。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文結(jié)果如圖 1-1，1-2，1-3 所示（僅選取部分新生小鼠鑒定結(jié)果）。圖中 M約 250 bp 處可見明顯、特異的 PCR 擴增條帶，與引物所對應(yīng)的 Aynuclein 擴增基因片段（248 bp）的預(yù)期位置相符，說明出現(xiàn)該特異擴增鼠為轉(zhuǎn)基因 PD 陽性小鼠，未出現(xiàn)該擴增基因片段的小鼠則為轉(zhuǎn)基因 P鼠。圖 1-2，1-3 展示了小鼠基因組 DNA 的內(nèi)參基因β-actin 的擴增結(jié)每只新生小鼠在 320 bp 處有明顯且特異的擴增條帶，說明所提小鼠 均較成功，且可用于 A53T α-synuclein 目的基因的鑒定。

示每只新生小鼠在 320 bp 處有明顯且特異的擴增條帶，說明所提小鼠 D本均較成功，且可用于 A53T α-synuclein 目的基因的鑒定。圖 1-1 A53T α-synuclein 轉(zhuǎn)基因 PD 小鼠目的基因電泳圖Fig. 1-1 Electrophoretic figure of the target gene in A53T α-synuclein transgenic PD mic：1~11 表示小鼠編號；K.表示空白組；N.陰性組；M.Marker（DL2000）；TG.目的基

圖 1-3 內(nèi)參基因基因電泳圖Fig. 1-3 Internal gene electrophoretic figure：1~13 表示小鼠編號；K.表示空白組；N.陰性組；M.Marker（DL2000）；Internal cont內(nèi)參基因.2.2 新生小鼠基因型鑒定結(jié)果統(tǒng)計將離乳并存活下來的 140 只健康新生小鼠進行基因型鑒定，基因型匯總見表 1-4，結(jié)果表明：140 只離乳新生小鼠中雄性小鼠 80 只，其中陰性小鼠 ，陽性小鼠 42 只；雌性小鼠 60 只，其中陰性小鼠 28 只，陽性小鼠 32 只表 1-4 新生小鼠基因型匯總表Table 1-4 Genotypic summary of newborn mouse雄性 雌性出生月份新生小鼠數(shù)量陰性小鼠 陽性小鼠 陰性小鼠 陽性小鼠

【參考文獻】

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本文編號：2796190