發(fā)布時(shí)間：2020-08-18 11:58

【摘要】：目的:研究天麻對(duì)A53Tα-突觸核蛋白(α-synuclein)轉(zhuǎn)基因帕金森小鼠的保護(hù)作用,并從基因轉(zhuǎn)錄組層面探索天麻發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用及其改善帕金森病(Parkinson’s disease,PD)癥狀的分子機(jī)制。方法:1.采用A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,進(jìn)行小鼠擴(kuò)增繁殖,通過鼠尾基因型鑒定試驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)基因PD陽性小鼠,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。2.采用4月齡A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠,設(shè)置空白組、模型組、陽性組、天麻高(14.4 g·kg~(-1))、中(7.2 g·kg~(-1))、低劑量組(0.72 g·kg~(-1)),連續(xù)灌胃給藥4周,對(duì)小鼠進(jìn)行爬桿行為學(xué)檢測、中腦黑質(zhì)組織蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)。3.通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)構(gòu)建空白組與模型組、模型組與天麻組小鼠中腦黑質(zhì)組織的轉(zhuǎn)錄組文庫,篩選差異表達(dá)基因,利用GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋和富集分析,綜合分析篩選出天麻保護(hù)轉(zhuǎn)基因PD小鼠神經(jīng)元的關(guān)鍵基因及代謝通路,利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證候選基因c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3,NPY,RASGRP1,DRD3的表達(dá)豐度。結(jié)果:1.繁殖共獲得140只離乳小鼠,80雄60雌,經(jīng)基因型鑒定轉(zhuǎn)基因PD陽性小鼠共74只,其中42雄32雌。2.爬桿行為學(xué)結(jié)果顯示,與空白組相比模型組、陽性組、天麻高、中、低劑量組得分總數(shù)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);天麻高、中、低劑量組得分總數(shù)均高于模型組且低于空白組,其中天麻中劑量組分?jǐn)?shù)最接近于陽性組,效果最為明顯,但與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.HE染色及神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果顯示與空白組相比模型組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且形態(tài)上可觀察到模型組部分神經(jīng)胞體深染、膠質(zhì)細(xì)胞增生,出現(xiàn)帕金森病癥;天麻中劑量組與模型組神經(jīng)元計(jì)數(shù)比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且天麻中劑量神經(jīng)元數(shù)量接近陽性組,形態(tài)上觀察到天麻中劑量組殘存的黑質(zhì)神經(jīng)元較多,細(xì)長、深染的神經(jīng)元的數(shù)量較少,而天麻高、低劑量組黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量較少。4.經(jīng)爬桿行為學(xué)試驗(yàn)、HE染色及神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果表明,天麻中劑量(7.2g·kg~(-1))為轉(zhuǎn)基因PD小鼠的最適給藥劑量。5.轉(zhuǎn)錄測序共獲得74.34 Gb Clean Data,各樣品Clean Data均達(dá)到7.04 Gb,Q30堿基百分比在85.92%及以上,各樣品與參考基因的比對(duì)效率從79.70%到86.35%不等,比對(duì)效率較高。6.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明,空白組比對(duì)模型組共篩選出788個(gè)差異基因,其中369個(gè)基因表達(dá)上調(diào),419個(gè)差異基因表達(dá)下調(diào),差異基因功能注釋后分布于215條通路;模型組比對(duì)天麻組顯示共篩選出466個(gè)差異基因,其中292個(gè)基因表達(dá)上調(diào),174個(gè)基因表達(dá)下調(diào),差異基因功能注釋后分布于177條通路,經(jīng)GO、KEGG共同富集分析顯示模型組中明顯激活的為神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ca~(2+)信號(hào)通路、Ras(大鼠肉瘤原癌基因)通路,與模型組比較關(guān)鍵基因c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3在天麻組中表達(dá)下調(diào),而NPY,RASGRP1,DRD3在天麻組中表達(dá)上調(diào),最后經(jīng)qRT-PCR試驗(yàn)得以驗(yàn)證。結(jié)論:1.A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠可較好的模擬帕金森的發(fā)病進(jìn)展,作為PD模型動(dòng)物應(yīng)用于研究中較為穩(wěn)定可靠。2.天麻水煎液可改善A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠的活動(dòng)能力及中腦黑質(zhì)神經(jīng)元病變,特別是天麻中劑量組(7.2 g·kg~(-1))效果較為明顯。3.本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)未給予天麻、給予天麻治療A53T轉(zhuǎn)基因PD小鼠及空白正常小鼠的中腦黑質(zhì)組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,結(jié)果表明PD發(fā)病與神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ca~(2+)信號(hào)通路、Ras等通路的激活相關(guān),天麻發(fā)揮PD保護(hù)作用可能與下調(diào)c-Fos,p38MAPK,MAPKAPK3等調(diào)亡相關(guān)基因,上調(diào)NPY,RASGRP1,DRD3等神經(jīng)營養(yǎng)因子及遞質(zhì)相關(guān)基因有關(guān),6個(gè)候選基因在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路、Ras通路上富集較為顯著,可能為天麻發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,治療PD的靶基因。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文結(jié)果如圖 1-1，1-2，1-3 所示（僅選取部分新生小鼠鑒定結(jié)果）。圖中 M約 250 bp 處可見明顯、特異的 PCR 擴(kuò)增條帶，與引物所對(duì)應(yīng)的 Aynuclein 擴(kuò)增基因片段（248 bp）的預(yù)期位置相符，說明出現(xiàn)該特異擴(kuò)增鼠為轉(zhuǎn)基因 PD 陽性小鼠，未出現(xiàn)該擴(kuò)增基因片段的小鼠則為轉(zhuǎn)基因 P鼠。圖 1-2，1-3 展示了小鼠基因組 DNA 的內(nèi)參基因β-actin 的擴(kuò)增結(jié)每只新生小鼠在 320 bp 處有明顯且特異的擴(kuò)增條帶，說明所提小鼠 均較成功，且可用于 A53T α-synuclein 目的基因的鑒定。

示每只新生小鼠在 320 bp 處有明顯且特異的擴(kuò)增條帶，說明所提小鼠 D本均較成功，且可用于 A53T α-synuclein 目的基因的鑒定。圖 1-1 A53T α-synuclein 轉(zhuǎn)基因 PD 小鼠目的基因電泳圖Fig. 1-1 Electrophoretic figure of the target gene in A53T α-synuclein transgenic PD mic：1~11 表示小鼠編號(hào)；K.表示空白組；N.陰性組；M.Marker（DL2000）；TG.目的基

圖 1-3 內(nèi)參基因基因電泳圖Fig. 1-3 Internal gene electrophoretic figure：1~13 表示小鼠編號(hào)；K.表示空白組；N.陰性組；M.Marker（DL2000）；Internal cont內(nèi)參基因.2.2 新生小鼠基因型鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)將離乳并存活下來的 140 只健康新生小鼠進(jìn)行基因型鑒定，基因型匯總見表 1-4，結(jié)果表明：140 只離乳新生小鼠中雄性小鼠 80 只，其中陰性小鼠 ，陽性小鼠 42 只；雌性小鼠 60 只，其中陰性小鼠 28 只，陽性小鼠 32 只表 1-4 新生小鼠基因型匯總表Table 1-4 Genotypic summary of newborn mouse雄性 雌性出生月份新生小鼠數(shù)量陰性小鼠 陽性小鼠 陰性小鼠 陽性小鼠

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王慧新;;帕金森病的中醫(yī)治療[J];吉林中醫(yī)藥;2015年08期

2 劉佳;段春禮;楊慧;;帕金森病發(fā)病機(jī)制與治療研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2015年03期

3 李娟娟;劉志濤;王曉雯;阮元;張強(qiáng);余思洋;萬青青;萬蓉;;天麻的研究現(xiàn)狀與展望[J];中國民族民間醫(yī)藥;2014年14期

4 孫新亭;孫曉靜;;天麻素對(duì)腦外傷大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制研究[J];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2014年06期

5 魏子峰;劉江;周洪霞;張?zhí)?張作鳳;李冉;張宇新;;p38MAPK抑制劑對(duì)MPTP模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2014年03期

6 陳慧;艾國;黃正明;;天麻最細(xì)粉和普通粉對(duì)帕金森病大鼠神經(jīng)行為學(xué)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)炎癥反應(yīng)的對(duì)比研究[J];中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2014年03期

7 陳小兵;張瑞;張佳佳;劉遠(yuǎn)新;;天麻鉤藤飲合鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯治療帕金森病臨床觀察[J];新疆中醫(yī)藥;2013年05期

8 陳衍晨;趙丹;卿娣;程?hào)|良;毛姣玉;王斌;;缺氧再灌注斑馬魚胚胎腦部細(xì)胞凋亡及c-fos基因的表達(dá)[J];中國組織工程研究;2013年37期

9 許藝超;石松生;;PI3K/Akt信號(hào)通路在腦缺血神經(jīng)元凋亡中作用的研究進(jìn)展[J];國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志;2012年06期

10 張麗;張連峰;;α-synuclein致病機(jī)制和轉(zhuǎn)基因帕金森疾病模型研究進(jìn)展[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2012年11期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王歡;基于RNA-seq技術(shù)的乙肝相關(guān)肝硬化肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 袁航;人胃癌組織中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的分離及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)[D];貴州醫(yī)科大學(xué);2017年

2 李美含;刺激前庭器官對(duì)大鼠部分基底神經(jīng)節(jié)c-Fos蛋白表達(dá)的影響[D];延邊大學(xué);2016年

3 左寶旭;PI3K/Akt信號(hào)通路在阿爾茨海默病、帕金森病患者外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及意義[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2796190