發(fā)布時間：2020-08-14 15:17

【摘要】：丹參作為中藥中常用大宗中藥材,應用極廣,能夠在心腦血管等多種疾病治療中起到良好療效,市場需求量大。但是在中藥材市場上,丹參的種質來源混亂,產地初加工及生產加工不一,對于丹參從種植、產地初加工到生產成品的過程中,沒有統(tǒng)一規(guī)范化的標準進行指導,從而導致市場上的丹參質量不一,甚至出現(xiàn)大量不合格的丹參流通于市場。本文進行發(fā)汗與非發(fā)汗兩種不同炮制工藝下丹參提取物在體內外對于P-gp影響的研究,旨在為丹參的產地初加工提供一定的科學依據(jù)。目的:本課題選取人肝癌HepG2細胞研究發(fā)汗與非發(fā)汗丹參提取物對HepG2細胞內P-gp功能及表達的影響研究,接著進行發(fā)汗與非發(fā)汗丹參提取物給藥大鼠,研究其對大鼠體內肝、腸、腦、腎、心臟P-gp表達影響的研究。方法:體外實驗中,MTT實驗確定發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物和丹參酮提取物對于HepG2細胞的最佳給藥濃度,接著通過Rho-123實驗檢測發(fā)汗與非發(fā)汗丹參提取物對HepG2細胞P-gp功能影響的研究,然后通過RT-PCR和Western blot法進行其發(fā)汗與非發(fā)汗丹參提取物對于P-gp的mRNA和蛋白表達影響的研究。體內實驗,通過給藥大鼠發(fā)汗與非發(fā)汗丹參提取物,采用RT-PCR和Western blot法進行其發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物和丹參酮提取物對于大鼠肝、腸、腦、腎、心臟P-gp表達影響的研究。結果:采用MTT實驗確定發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物和丹參酮提取物對HepG2細胞的給藥濃度:丹酚酸類提取物濃度為20、100、500μg/mL;丹參酮提取物濃度為2、10、50μg/mL。Rho-123實驗檢測發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物和丹參酮提取物對HepG2細胞P-gp功能的影響,積累和外排的實驗結果表明發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物類20、100μg/mL對于HepG2細胞P-gp無影響,50μg/mL時有一定的誘導作用,且其發(fā)汗要比非發(fā)汗丹參總酚酸提取物誘導作用強;發(fā)汗與非發(fā)汗丹參酮提取物濃度2μg/mL對于HepG2細胞P-gp無影響,當濃度為10、50μg/mL對其HepG2細胞P-gp有抑制作用,且隨著濃度的增加,抑制作用更強,同等濃度下其發(fā)汗要比非發(fā)汗丹參丹參酮提取物抑制作用更強。RT-PCR和Western blot實驗結果與Rho-123實驗結果基本一致。最后采用RT-PCR和Western blot法進行其發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物和丹參酮提取物對于大鼠肝、腸、腦、腎、心臟P-gp表達影響的研究,結果表明發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物對于大鼠肝、腸、腦、腎、心臟P-gp表達無影響,發(fā)汗與非發(fā)汗丹參酮提取物對于大鼠肝、腸、腦、腎P-gp表達有抑制作用,且發(fā)汗要比非發(fā)汗丹參丹參酮提取物抑制作用更強;但是對于心臟P-gp表達則無影響。結論:體內外實驗表明發(fā)汗與非發(fā)汗丹參總酚酸提取物正常給藥濃度對于其P-gp功能和表達無影響,提高濃度可能對于P-gp功能和表達有誘導作用,且發(fā)汗要比非發(fā)汗丹參總酚酸提取物誘導作用強。發(fā)汗與非發(fā)汗丹參酮提取物低濃度對于P-gp功能和表達無影響,正常給藥濃度對其有抑制作用,隨著濃度的增加,抑制作用更強,且發(fā)汗要比非發(fā)汗丹參酮提取物對P-gp抑制作用更強。本實驗可為丹參的產地初加工提供一定的科學依據(jù),且能夠為丹參及其提取物聯(lián)合使用其抗癌、抗腫瘤等多藥耐藥藥物提供一定的理論基礎。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

即可加入同體積完全培養(yǎng)基進行終止消化胞完全脫落，吸取細胞混懸液于 15 mL 離心。去除上清液，加入適量完全培養(yǎng)基，輕柔吹養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿/六孔板/96 孔板。放入 37℃、5%的細胞培養(yǎng)至培養(yǎng)瓶 80-90%時，可進行細胞操作，離心后棄去舊的培養(yǎng)基，加入配好的，移入細胞凍存管，旋緊凍存管蓋子，用封，隨后放入-20℃冰箱放置 2 小時，隨后放入罐長期保存。學觀察與計數(shù)

圖 2 發(fā)汗與非發(fā)汗丹參酮提取物給藥培養(yǎng) 8、24、48 h 后 HepG2 細胞活力圖與空白對照相比，*P <0.05，＃P <0.001。Fig2Activity of HepG2 cells after administration of sweating and non-sweatingtanshinone extract for 8, 24 and 48 hours,Compared with the blank control group,*P <0.05，＃P <0.001.表 2 發(fā)汗與非發(fā)汗丹參酮提取物給藥培養(yǎng) 8、24、48 h 后 HepG2 細胞的存活率（Mean±SD, n=3）Tab2 Survival rate of HepG2 cells after administration of sweating and non-sweatintanshinone extracts for 8, 24 and 48 hours (Mean±SD, n=3)物度HepG2 細胞存活率（100%）NSTN 組 STN 組

圖 3 發(fā)汗與非發(fā)汗丹參提取物對 HepG2 細胞內羅丹明D、E、F、G、H、I、J 分別為空白對照組、維拉帕米酸提取物組、發(fā)汗丹參總酚酸提取物組（100 μg/mL）發(fā)汗丹參酮提取物組（2 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL空白對照組相比，**p<0.01，***Fig3 Effects of sweating and non-sweating salvia miltiorof rhodamine 123 in HepG2 cells. D, E, F, G, H, I, and verapamil inhibitor group, non-sweating and sweating sa(100 μg/mL), non-sweating and sweating tanshinone eμg/mL、50 μg/mL). K is a the resulty statistical analyscontrol group, **p<0.01，***p<

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5 李W

本文編號：2793197