發(fā)布時(shí)間：2020-08-14 13:59

【摘要】：目的膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis associated encephalopathy,SAE)是膿毒癥的常見并發(fā)癥,它的出現(xiàn)與膿毒癥患者的病死率增高、遠(yuǎn)期認(rèn)知功能、生活質(zhì)量密切相關(guān)。這種遠(yuǎn)期認(rèn)知損傷的機(jī)制尚不明確,預(yù)防和改善SAE疾病還沒有有效的方法。因此本研究采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)構(gòu)建膿毒癥小鼠模型,通過對(duì)存活小鼠的行為評(píng)價(jià),利用雙光子顯微鏡檢測(cè)腦類淋巴清除通道功能,以及靶向代謝組學(xué)研究相關(guān)代謝物,探討SAE的腦損傷機(jī)制,為SAE的治療提供理論基礎(chǔ)。同時(shí),基于所建立的SAE疾病模型,初步評(píng)價(jià)加味補(bǔ)陽還五湯(JBH-5)對(duì)SAE的治療作用以及對(duì)腦代謝物清除的影響。方法1.膿毒癥對(duì)小鼠腦類淋巴通道的影響采用CLP手術(shù)誘發(fā)小鼠膿毒癥,對(duì)急性膿毒癥存活小鼠進(jìn)行術(shù)后11 d及30 d的行為學(xué)分析及術(shù)后30 d腦組織的病理變化及神經(jīng)元的損傷情況;通過雙光子熒光活體成像技術(shù)對(duì)術(shù)后30 d小鼠的腦血管旁通道進(jìn)行活體監(jiān)測(cè);同時(shí)利用免疫熒光檢測(cè)48 h和30 d小鼠腦組織中神經(jīng)元(Neun)、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)和水通道蛋白4(AQP4)的極化水平;基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS),采用靶向代謝組學(xué)的研究手段,挖掘CLP術(shù)后30 d存在認(rèn)知損傷的小鼠腦組織的生物標(biāo)志物。2.JBH-5對(duì)小鼠膿毒癥腦病的改善作用將9~10 W的C57/B6雄性小鼠隨機(jī)分成Sham組、CLP組、陽性對(duì)照組(頭孢哌酮0.2275 g/kg)、JBH-5高劑量組(50 g/kg)、JBH-5中劑量組(25 g/kg)、JBH-5低劑量組(12.5 g/kg)。采用CLP法建立小鼠SAE模型,術(shù)后連續(xù)給藥30 d后,對(duì)不同組小鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試行為學(xué)指標(biāo),HE染色及尼氏染色觀察腦組織病理學(xué)變化;利用雙光子活體成像技術(shù)測(cè)定小鼠腦旁血管清除通路功能,以及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及AQP4的變化。結(jié)果1.膿毒癥對(duì)小鼠腦類淋巴通道的影響CLP手術(shù)12 d后小鼠的存活率為35%;術(shù)后24 h CLP組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P0.05);術(shù)后11 d及30 d的行為學(xué)分析結(jié)果表明CLP組小鼠出現(xiàn)空間記憶認(rèn)知能力的損傷。術(shù)后30 d的HE染色及尼氏染色顯示CLP組小鼠的腦組織出現(xiàn)損傷及海馬體神經(jīng)元數(shù)目減少。術(shù)后30 d的雙光子活體成像結(jié)果表明,腦脊液熒光示蹤劑在CLP小鼠腦實(shí)質(zhì)和腦血管周圍間隙中出現(xiàn)堆積,且在腦實(shí)質(zhì)組織中的清除速率明顯減慢。術(shù)后48 h及30 d CLP小鼠腦組織的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)增多,而膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Iba1)在術(shù)后48 h顯著活化,到術(shù)后30 d則為靜息狀態(tài),且AQP4主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體區(qū)域,即其極化水平顯著降低(P0.05)。術(shù)后30 d的靶向代謝組學(xué)結(jié)果顯示存在認(rèn)知損傷的CLP小鼠腦內(nèi)存在15個(gè)差異代謝物,其中腺嘌呤核苷酸(AMP)、次黃嘌呤核苷酸(IMP)、黃嘌呤核苷、鳥苷、尿酸這5個(gè)生物標(biāo)志物涉及嘌呤代謝途徑。高表達(dá)的尿酸可能為SAE診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。2.JBH-5對(duì)小鼠膿毒癥腦病的改善作用與CLP對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組及JBH-5低劑量組術(shù)后12 d的存活率及術(shù)后24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯提高(P0.05)。給藥30 d后的行為學(xué)分析表明,JBH-5低劑量組小鼠空間記憶認(rèn)知能力明顯改善。腦組織病理觀察可知,給藥30 d后的JBH-5具有改善由于CLP導(dǎo)致的海馬區(qū)神經(jīng)元固縮、深染、神經(jīng)元細(xì)胞減少的情況。熒光示蹤劑在JBH-5小鼠腦實(shí)質(zhì)組織中的清除速率明顯加快(P0.05),有效降低熒光示蹤劑在腦實(shí)質(zhì)和腦血管周圍間隙中的堆積,且小鼠腦組織中的GFAP活化減少(P0.05),各組Iba1無明顯變化。JBH-5組中AQP4主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞端足區(qū)域,與CLP組比較極化水平顯著提高(P0.05)。結(jié)論1.膿毒癥存活小鼠能引起學(xué)習(xí)和空間識(shí)別記憶能力的下降。2.膿毒癥引起小鼠腦類淋巴清除通道發(fā)生顯著損傷,星形膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)過度活化,AQP4去極化。3.膿毒癥引起小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞一過性活化,星形膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)過度活化,神經(jīng)元減少。4.腦靶向代謝組學(xué)結(jié)果顯示,CLP模型中存在認(rèn)知損傷的小鼠主要表現(xiàn)嘌呤代謝紊亂,腦內(nèi)尿酸增多。5.JBH-5能顯著改善由CLP引起的小鼠空間記憶認(rèn)知功能的損傷。6.JBH-5能改善膿毒癥小鼠類淋巴清除通路功能,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化,降低AQP4去極化水平。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

被清除出腦實(shí)質(zhì)，是腦內(nèi)代謝物清除的重要途徑之一。針對(duì)活體腦內(nèi)類淋巴系統(tǒng)的研究，在帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病及其他神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病模型國內(nèi)外陸續(xù)有報(bào)道，正常大腦與腦損傷的淋巴通路對(duì)比如圖1-2所示[29]。生理?xiàng)l件下，腦血管周圍間隙在腦脊液與腦組織間液的液體引流、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面有重要的作用，因此血管周圍間隙的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能可為認(rèn)識(shí)SAE的病理、生理過程提供全新的視角[30]。圖 1-2 健康大腦和腦損傷淋巴通路功能示意圖[29]Figure 1-2Aschematic diagram of the function of the glymphatic pathways in the healthy brain andbrain injury星形膠質(zhì)細(xì)胞的水轉(zhuǎn)運(yùn)通道與類淋巴系統(tǒng)功能的維持密切相關(guān)，通過星形膠質(zhì)細(xì)胞端足上的水通道蛋白4（Aquaporin 4,AQP4）構(gòu)成的水通道，促使CSF-ISF進(jìn)行液體交換，排除腦組織之間的代謝物。APQ4是腦組織中表達(dá)最多的水通道蛋白，是構(gòu)成星形膠質(zhì)細(xì)胞的水轉(zhuǎn)運(yùn)通道重要蛋白。生理情況下，它以一種高度極化的方式在血管周圍的星形細(xì)胞端足上表達(dá)

觀察記錄小鼠情況并進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[58]，評(píng)分項(xiàng)目見圖2-1。同時(shí)，對(duì)小鼠生存率進(jìn)行 12 d 的統(tǒng)計(jì)、以及 11 d 和 30 d 小鼠體重的恢復(fù)情況。CLP 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)采集小鼠 110 μL 血樣，將其中 50 μL 作為血液原液，吸取剩余 50 μL用無菌 PBS 連續(xù)稀釋（1:9）。將稀釋液和原液均勻涂布在胰蛋白酶血平板上，每個(gè)稀釋液梯度做兩個(gè)重復(fù)涂板。將平板放在恒溫培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng) 24 h 后計(jì)算每個(gè)樣品的菌落數(shù)檢測(cè)小鼠血液細(xì)菌量。載菌量（CFU/mL）=同一稀釋度兩個(gè)平皿上菌落的平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×20。CLP 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)采集抗凝血，通過血液分析儀檢測(cè)白細(xì)胞（WBC）的變化。CLP 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)采集血漿，利用 Luminex 液相芯片技術(shù)檢測(cè)白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α?

出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，小鼠出現(xiàn)死亡。型小鼠認(rèn)知功能的變化1 2 3 4 5 6 7CLP: 11 dSham: 30 dCLP: 30 dSham: 11 d************時(shí)間 （d）11 300246* **術(shù) 后時(shí)間 （d）穿越平臺(tái)次數(shù)11 30ShamCLP**術(shù) 后時(shí)間 （d）11 3001020304050ShamCLP*術(shù)后時(shí)間 （d）象限距離百分比%11 3005101520*術(shù)后時(shí)間 （d）平均游泳速度(m/s) (b)(d) (e))

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2793120