【摘要】：目的膿毒癥相關性腦病(sepsis associated encephalopathy,SAE)是膿毒癥的常見并發(fā)癥,它的出現(xiàn)與膿毒癥患者的病死率增高、遠期認知功能、生活質(zhì)量密切相關。這種遠期認知損傷的機制尚不明確,預防和改善SAE疾病還沒有有效的方法。因此本研究采用經(jīng)典的盲腸結扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)構建膿毒癥小鼠模型,通過對存活小鼠的行為評價,利用雙光子顯微鏡檢測腦類淋巴清除通道功能,以及靶向代謝組學研究相關代謝物,探討SAE的腦損傷機制,為SAE的治療提供理論基礎。同時,基于所建立的SAE疾病模型,初步評價加味補陽還五湯(JBH-5)對SAE的治療作用以及對腦代謝物清除的影響。方法1.膿毒癥對小鼠腦類淋巴通道的影響采用CLP手術誘發(fā)小鼠膿毒癥,對急性膿毒癥存活小鼠進行術后11 d及30 d的行為學分析及術后30 d腦組織的病理變化及神經(jīng)元的損傷情況;通過雙光子熒光活體成像技術對術后30 d小鼠的腦血管旁通道進行活體監(jiān)測;同時利用免疫熒光檢測48 h和30 d小鼠腦組織中神經(jīng)元(Neun)、小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞的表達和水通道蛋白4(AQP4)的極化水平;基于液質(zhì)聯(lián)用技術(LC-MS/MS),采用靶向代謝組學的研究手段,挖掘CLP術后30 d存在認知損傷的小鼠腦組織的生物標志物。2.JBH-5對小鼠膿毒癥腦病的改善作用將9~10 W的C57/B6雄性小鼠隨機分成Sham組、CLP組、陽性對照組(頭孢哌酮0.2275 g/kg)、JBH-5高劑量組(50 g/kg)、JBH-5中劑量組(25 g/kg)、JBH-5低劑量組(12.5 g/kg)。采用CLP法建立小鼠SAE模型,術后連續(xù)給藥30 d后,對不同組小鼠進行Morris水迷宮測試行為學指標,HE染色及尼氏染色觀察腦組織病理學變化;利用雙光子活體成像技術測定小鼠腦旁血管清除通路功能,以及免疫熒光技術檢測各組小鼠腦組織小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞及AQP4的變化。結果1.膿毒癥對小鼠腦類淋巴通道的影響CLP手術12 d后小鼠的存活率為35%;術后24 h CLP組小鼠神經(jīng)行為學評分顯著降低(P0.05);術后11 d及30 d的行為學分析結果表明CLP組小鼠出現(xiàn)空間記憶認知能力的損傷。術后30 d的HE染色及尼氏染色顯示CLP組小鼠的腦組織出現(xiàn)損傷及海馬體神經(jīng)元數(shù)目減少。術后30 d的雙光子活體成像結果表明,腦脊液熒光示蹤劑在CLP小鼠腦實質(zhì)和腦血管周圍間隙中出現(xiàn)堆積,且在腦實質(zhì)組織中的清除速率明顯減慢。術后48 h及30 d CLP小鼠腦組織的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達增多,而膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Iba1)在術后48 h顯著活化,到術后30 d則為靜息狀態(tài),且AQP4主要表達在星形膠質(zhì)細胞胞體區(qū)域,即其極化水平顯著降低(P0.05)。術后30 d的靶向代謝組學結果顯示存在認知損傷的CLP小鼠腦內(nèi)存在15個差異代謝物,其中腺嘌呤核苷酸(AMP)、次黃嘌呤核苷酸(IMP)、黃嘌呤核苷、鳥苷、尿酸這5個生物標志物涉及嘌呤代謝途徑。高表達的尿酸可能為SAE診斷和治療的潛在生物標志物。2.JBH-5對小鼠膿毒癥腦病的改善作用與CLP對照組比較,陽性對照組及JBH-5低劑量組術后12 d的存活率及術后24 h神經(jīng)行為學評分明顯提高(P0.05)。給藥30 d后的行為學分析表明,JBH-5低劑量組小鼠空間記憶認知能力明顯改善。腦組織病理觀察可知,給藥30 d后的JBH-5具有改善由于CLP導致的海馬區(qū)神經(jīng)元固縮、深染、神經(jīng)元細胞減少的情況。熒光示蹤劑在JBH-5小鼠腦實質(zhì)組織中的清除速率明顯加快(P0.05),有效降低熒光示蹤劑在腦實質(zhì)和腦血管周圍間隙中的堆積,且小鼠腦組織中的GFAP活化減少(P0.05),各組Iba1無明顯變化。JBH-5組中AQP4主要表達在星形膠質(zhì)細胞端足區(qū)域,與CLP組比較極化水平顯著提高(P0.05)。結論1.膿毒癥存活小鼠能引起學習和空間識別記憶能力的下降。2.膿毒癥引起小鼠腦類淋巴清除通道發(fā)生顯著損傷,星形膠質(zhì)細胞持續(xù)過度活化,AQP4去極化。3.膿毒癥引起小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞一過性活化,星形膠質(zhì)細胞持續(xù)過度活化,神經(jīng)元減少。4.腦靶向代謝組學結果顯示,CLP模型中存在認知損傷的小鼠主要表現(xiàn)嘌呤代謝紊亂,腦內(nèi)尿酸增多。5.JBH-5能顯著改善由CLP引起的小鼠空間記憶認知功能的損傷。6.JBH-5能改善膿毒癥小鼠類淋巴清除通路功能,抑制星形膠質(zhì)細胞的過度活化,降低AQP4去極化水平。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

被清除出腦實質(zhì)，是腦內(nèi)代謝物清除的重要途徑之一。針對活體腦內(nèi)類淋巴系統(tǒng)的研究，在帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病及其他神經(jīng)炎癥相關疾病模型國內(nèi)外陸續(xù)有報道，正常大腦與腦損傷的淋巴通路對比如圖1-2所示[29]。生理條件下，腦血管周圍間隙在腦脊液與腦組織間液的液體引流、物質(zhì)轉(zhuǎn)運方面有重要的作用，因此血管周圍間隙的物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能可為認識SAE的病理、生理過程提供全新的視角[30]。圖 1-2 健康大腦和腦損傷淋巴通路功能示意圖[29]Figure 1-2Aschematic diagram of the function of the glymphatic pathways in the healthy brain andbrain injury星形膠質(zhì)細胞的水轉(zhuǎn)運通道與類淋巴系統(tǒng)功能的維持密切相關，通過星形膠質(zhì)細胞端足上的水通道蛋白4（Aquaporin 4,AQP4）構成的水通道，促使CSF-ISF進行液體交換，排除腦組織之間的代謝物。APQ4是腦組織中表達最多的水通道蛋白，是構成星形膠質(zhì)細胞的水轉(zhuǎn)運通道重要蛋白。生理情況下，它以一種高度極化的方式在血管周圍的星形細胞端足上表達

觀察記錄小鼠情況并進行神經(jīng)行為學評分[58]，評分項目見圖2-1。同時，對小鼠生存率進行 12 d 的統(tǒng)計、以及 11 d 和 30 d 小鼠體重的恢復情況。CLP 術后各時間點采集小鼠 110 μL 血樣，將其中 50 μL 作為血液原液，吸取剩余 50 μL用無菌 PBS 連續(xù)稀釋（1:9）。將稀釋液和原液均勻涂布在胰蛋白酶血平板上，每個稀釋液梯度做兩個重復涂板。將平板放在恒溫培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng) 24 h 后計算每個樣品的菌落數(shù)檢測小鼠血液細菌量。載菌量（CFU/mL）=同一稀釋度兩個平皿上菌落的平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×20。CLP 術后各時間點采集抗凝血，通過血液分析儀檢測白細胞（WBC）的變化。CLP 術后各時間點采集血漿，利用 Luminex 液相芯片技術檢測白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α?

出現(xiàn)細胞因子風暴，小鼠出現(xiàn)死亡。型小鼠認知功能的變化1 2 3 4 5 6 7CLP: 11 dSham: 30 dCLP: 30 dSham: 11 d************時間 （d）11 300246* **術 后時間 （d）穿越平臺次數(shù)11 30ShamCLP**術 后時間 （d）11 3001020304050ShamCLP*術后時間 （d）象限距離百分比%11 3005101520*術后時間 （d）平均游泳速度(m/s) (b)(d) (e))

【參考文獻】

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本文編號：2793120