【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精以外的其他因素導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積,其發(fā)展過(guò)程一般包括肝臟的單純性脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化等病變,嚴(yán)重的會(huì)產(chǎn)生肝硬化,肝臟衰竭甚至肝癌。在西方國(guó)家,NAFLD影響約30%的普通人群。近20年,其在亞洲國(guó)家增長(zhǎng)迅速且呈低齡化發(fā)病趨勢(shì),中國(guó)上海、廣州和香港等發(fā)達(dá)地區(qū)成人NAFLD患病率約為15%。該病的患病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)增加,與肥胖癥的增加成平行關(guān)系,日趨成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前眾多國(guó)際指南關(guān)于早期NAFLD的治療策略主要集中在改變生活方式,以及防治伴隨的代謝、心血管并發(fā)癥。但是發(fā)展到后期,必須要采用針對(duì)肝臟的藥物治療,阻止肝病進(jìn)展,減少或預(yù)防肝硬化肝癌及其并發(fā)癥的發(fā)生。現(xiàn)有的降脂、降糖、降壓藥,如降血脂類藥物他汀類(Statins)、貝特類(Fibrates),能夠降低血脂,與此同時(shí)容易導(dǎo)致肝毒性,誘發(fā)加劇肝損傷;降血糖類藥物二甲雙胍(metformin),增強(qiáng)胰島素敏感性,但是對(duì)肝臟的組織學(xué)病變并無(wú)明顯療效。因此保肝藥物,特別是特異性逆轉(zhuǎn)和治療肝臟脂肪病變、炎癥損傷,預(yù)防纖維化甚至肝硬化新藥的研發(fā)至關(guān)重要。NAFLD是遺傳-環(huán)境-代謝-應(yīng)激等多重因素共同作用的結(jié)果,與胰島素抵抗、高血糖及高血脂等代謝綜合征密切相關(guān)。在我們以往的研究中,發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾過(guò)程中的一個(gè)重要分支酶,催化法尼基焦磷酸鹽(farnesyl diphosphate,FPP)合成香葉基香葉基焦磷酸鹽(geranylgeranyl diphosphate,GGPP)的香葉基香葉基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)參與 了肥胖誘發(fā)的肝臟脂肪變性。GGPPS通過(guò)調(diào)控體內(nèi)FPP/GGPP的比例參與調(diào)控肝臟的脂質(zhì)代謝。敲除GGPPS能夠有效的緩解NAFLD的形成,因此我們提出以GGPPS為靶點(diǎn)篩選NAFLD有效治療藥物的研究方向。我們發(fā)現(xiàn)采用已知的GGPPS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制劑二磷酸鹽DGBP(Digeranyl bisphosphonate)處理高脂誘導(dǎo)NAFLD小鼠,肝臟脂質(zhì)積累得到有效抑制。由于DGBP較大的毒副作用,使得其針對(duì)NAFLD的病情控制較為局限。但是仍然提示我們以GGPPS為靶點(diǎn)抑制NAFLD的發(fā)展是一個(gè)很好的研究方向。在已有研究基礎(chǔ)上,我們針對(duì)GGPPS蛋白進(jìn)行構(gòu)象分析,與江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥物篩選平臺(tái)合作,初步計(jì)算機(jī)模擬篩選出46種可能與GGPPS特異性結(jié)合的化合物。隨后,我們構(gòu)建GGPPS綠色熒光融合蛋白,利用微量熱泳動(dòng)技術(shù)(MicroscaleThermophoresis,MST)進(jìn)一步鑒定出了一種與 GGPPS 蛋白直接結(jié)合的天然活性小分子化合物,即蘋(píng)果、蘋(píng)果樹(shù)皮及葉中存在的酚類物質(zhì)——疊氮化根皮苷素(4-Azidophlorizin,4-Az)。疊氮化根皮苷素曾被報(bào)道作為腎臟表達(dá)的鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 2(sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT-2)抑制劑,可以抑制腎臟對(duì)葡萄糖的重吸收,但是尚未有研究顯示4-Az是否具有抑制NAFLD的作用。因此,本文將著重研究4-Az是否能夠通過(guò)與GGPPS的結(jié)合,抑制肝臟甘油三酯的堆積并減緩NAFLD的發(fā)展。首先,我們利用GGPPS高表達(dá)的MEF細(xì)胞TSC2-null作為藥理研究模型,將篩選出的特異性結(jié)合藥物4-Az按照不同濃度及時(shí)間分別處理,GGPPS表達(dá)呈濃度、時(shí)間依賴性下降,轉(zhuǎn)錄水平無(wú)變化,預(yù)示GGPPS可能發(fā)生蛋白質(zhì)降解;同時(shí),分離4-Az處理后異戊二烯化(有機(jī)相)和非異戊二烯化(水相)的小G蛋白R(shí)hoA,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4-Az造成RhoA異戊二烯化水平下降,預(yù)示其引起GGPPS異戊二烯化功能的改變。隨后,我們分別在細(xì)胞和動(dòng)物水平進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞水平上,在GGPPS高表達(dá)引起的脂肪變性肝細(xì)胞中,4-Az引起GGPPS降解從而降低脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)。在游離脂肪酸處理的脂肪變性肝細(xì)胞模型中,4-Az通過(guò)下調(diào)GGPPS明顯減輕脂質(zhì)積累。動(dòng)物水平上,高脂喂養(yǎng)誘發(fā)小鼠發(fā)生肝臟脂肪變性,CT掃描結(jié)果顯示肝臟中脂質(zhì)含量增多,解剖后肝臟的整體外觀發(fā)白及腫脹,HE染色顯示大泡型脂肪變性。而在4-Az處理的小鼠肝臟中脂肪變性的表型明顯逆轉(zhuǎn),肝臟中的甘油三酯含量下降,同時(shí)血清中轉(zhuǎn)氨酶水平下降,肝功能改善。在機(jī)制研究方面,根據(jù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的兩個(gè)途徑,泛素化-蛋白酶體途徑和溶酶體途徑,我們利用兩種途徑的抑制劑MG132、CQ分別抑制藥物造成的蛋白質(zhì)降解,結(jié)果顯示MG132處理后GGPPS蛋白的泛素化程度加深,從而明確藥物造成的降解途徑為泛素化-蛋白酶體通路。我們進(jìn)一步利用免疫沉淀GGPPS結(jié)合蛋白的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)獲得可結(jié)合GGPPS的E3泛素化連接酶候選蛋白,從而明確4-Az引導(dǎo)GGPPS降解的具體機(jī)制。由此,我們研究表明,在游離脂肪酸處理的脂肪變性肝細(xì)胞及高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型中,4-Az都起到明顯降低脂質(zhì)積累的效果。這一現(xiàn)象主要是由于4-Az通過(guò)結(jié)合并引導(dǎo)高表達(dá)的GGPPS走向泛素化-蛋白酶體降解。以上結(jié)果顯示,4-Az很有可能是靶向GGPPS有效治療NAFLD的天然藥物小分子。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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