【摘要】：苦木科植物鴉膽子[Brucea javanica(Linnaeus)Merrill]是一種常綠闊葉灌木,常見于我國南方沿海省份如廣西、廣東、海南等地,以及在東南亞島國如印尼、馬來西亞、菲律賓等均有分布。其成熟果實(shí)鴉膽子又名鴨蛋子、老鴉膽、苦參子、苦榛子等,在中國,其被用作傳統(tǒng)的中草藥治療疾病已經(jīng)有多年的歷史,但與此同時,作為一種傳統(tǒng)的有毒植物,近年來也時有因誤服,用藥不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致中毒的事件發(fā)生。到目前為止,有150多種化合物已經(jīng)從鴉膽子的種子和果實(shí)中分離得到,其中70余種為苦木素類化合物。隨著人們對苦木素類化合物的不斷探索,多種多樣的生物活性得以證實(shí),其中,抗腫瘤的作用的發(fā)現(xiàn)讓人們對其有了新的認(rèn)識,并進(jìn)而可以通過對細(xì)胞的毒性作用來探索更為廣泛的毒理作用機(jī)制。本研究以鴉膽子成熟果實(shí)中純化分離的7種苦木素單體化合物為研究對象,檢測了它們對多組不同類別的癌細(xì)胞的增殖抑制作用,篩選出四種細(xì)胞毒性顯著的苦木素單體化合物,并對化合物Bruceine B抑制腫瘤細(xì)胞增殖的構(gòu)-效關(guān)系及作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。第一部分鴉膽子中7種苦木素類化合物對8種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性篩選目的:檢測7種苦木素類化合物(1)鴉膽苦素B(Bruceine B)、(2)鴉膽苦素A(Bruceine A)、(3)鴉膽苦素C(Bruceine C)、(4)鴉膽苦素D(Bruceine D)、(5)Dehydrobruceantinol、(6)Bruceaketolic acid、(7)Yadanzioside G對人肺癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制作用,以期篩選出具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞作用,尤其是抑制肺癌細(xì)胞的苦木素化合物。方法:采用4-氮唑鹽(MTT)法檢測7種苦木素類化合物對人肺癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞的抑制作用,并通過梯度濃度處理后的吸光度(OD)值百分比計算各組實(shí)驗(yàn)用苦木素化合物的IC_(50)值。結(jié)果:(1)100μmol/L的7種苦木素類化合物作用于三種人肺癌細(xì)胞(A549、NCI-H292和HCC827)后,化合物1、2、3、4對NCI-H292細(xì)胞顯示非常強(qiáng)的增殖抑制活性,增殖抑制率分別為82.93%、81.73%、82.69%和81.51%;對A549及HCC827的抑制率均未達(dá)到50%;(2)100μmol/L的7種苦木素類化合物處理人胃癌細(xì)胞AGS和人宮頸癌HeLa細(xì)胞后,化合物1、2、3、4均顯示出非常強(qiáng)的增殖抑制活性,增殖抑制率分別為77.78%、79.24%、76.09%、69.71%和96.58%、98.28%、98.52%、97.79%;(3)100μmol/L的7種苦木素類化合物處理三種人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(HEC-1-A、HEC-1-B和RL95-2)后,其抑制率均未達(dá)到50%;(3)化合物5、6、7對NCI-H292等全部實(shí)驗(yàn)用腫瘤細(xì)胞顯示出較弱的增殖抑制活性,抑制率均在20%以下;(4)通過梯度濃度的苦木素化合物1、2、3、4對三種人肺癌細(xì)胞增殖抑制率計算百分比,得到四種苦木素化合物的半數(shù)抑制濃度(IC_(50)),其中苦木素化合物1、2、3、4對NCI-H292細(xì)胞IC_(50)分別為0.70、1.17、0.54和1.46μmol/L。結(jié)論:從鴉膽子的成熟果實(shí)中分離提取的4種苦木素類化合物1、2、3和4對人肺腫瘤細(xì)胞NCI-H292等3種試驗(yàn)用細(xì)胞具有明顯的抑制活性;以C-20為母核結(jié)構(gòu)的苦木素類化合物的細(xì)胞毒活性與C-2位上的羰基有關(guān),改變其框架結(jié)構(gòu)或增加活性基團(tuán)可能會大大降低其細(xì)胞毒活性作用;延長C-15位上的側(cè)鏈長度對其細(xì)胞毒活性影響不大。第二部分鴉膽子中苦木素類化合物Bruceine B對NCI-H292細(xì)胞毒性作用的機(jī)制探討目的:已有報導(dǎo)發(fā)現(xiàn)中草藥制劑中很多成分都具有抗腫瘤活性,他們多是以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式來發(fā)揮作用的。在之前的篩選實(shí)驗(yàn)中,四種苦木素化合物(1)Bruceine B、(2)Bruceine A、(3)Bruceine C、(4)Bruceine D對肺癌細(xì)胞NCI-H292產(chǎn)生了明顯的抑制活性。本部分實(shí)驗(yàn)對(1)Bruceine B進(jìn)行作用機(jī)制方面的探討。方法:(1)采用流式細(xì)胞分析技術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法檢測1μmol/L和10μmol/L的苦木素類化合物Bruceine B作用NCI-H292細(xì)胞12h及24 h后細(xì)胞的凋亡;(2)采用TUNEL法檢測10μmol/L的苦木素類化合物Bruceine B作用于NCI-H292細(xì)胞后12及24 h細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化;(3)采用Western Blot法檢測苦木素類化合物Bruceine B作用NCI-H292細(xì)胞12及24 h后凋亡蛋白p53、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12及GRP78的變化。結(jié)果:(1)Bruceine B對NCI-H292細(xì)胞凋亡的影響:1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B處理NCI-H292細(xì)胞12 h后,細(xì)胞凋亡率分別達(dá)到(16.30±0.29)%和(18.72±0.45)%,與對照組(8.32±0.13)%相比,P0.05;1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B處理NCI-H292細(xì)胞24 h后,細(xì)胞凋亡率分別達(dá)到(29.56±1.24)%和(32.47±1.87)%,與對照組(9.01±0.33)%比較,P0.05。(2)TUNEL法進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞凋亡的發(fā)生:10μmol/L的苦木素類化合物Bruceine B作用NCI-H292細(xì)胞12 h及24 h,經(jīng)熒光顯微鏡觀察陽性細(xì)胞個數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分率分別是(14.89±1.27)%和(29.37±2.25)%,與對照組(4.17±0.36)%相比,P0.05。(3)Bruceine B對NCI-H292細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白p53、Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-12和GRP78的上調(diào)作用:1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B對NCI-H292細(xì)胞處理24 h后,細(xì)胞內(nèi)的凋亡通路蛋白p53、Bax、Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)均有增加,1μmol/L和10μmol/L的Bruceine B對NCI-H292細(xì)胞處理12 h后,Caspase-12及GRP78的表達(dá)明顯增加。結(jié)論:苦木素化合物Bruceine B對人肺癌NCI-H292細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡活性;Bruceine B誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡是通過多種途徑共同作用的結(jié)果,它可以通過上調(diào)NCI-H292細(xì)胞p53蛋白,而后激活促凋亡蛋白Bax,也可以由死亡受體執(zhí)行蛋白Caspase-8進(jìn)一步引起并最終通過Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞凋亡;值得注意的是,在低濃度的Bruceine B早期處理中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑GRP78和Caspase-12復(fù)合物的作用也可能為鴉膽子中苦木素類化合物Bruceine B引起NCI-H292細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

鴉膽子成熟果實(shí)Fig.1Bruceajavanica(L.)Merr.

圖 2 實(shí)驗(yàn)用 7 種苦木素類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of 7 quassinoid compoundsfrom Brucea javanica.

圖 3 鴉膽子中 7 種苦木素化合物抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用Fig.3 The effects of 7 quassinoid compounds from Brucea javanica on tproliferation of experimental cancer cells ( X±SD, n=3).

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本文編號：2790711