【摘要】：目的:探討丹參酮Ⅰ在腎臟缺血再灌注損傷中的保護作用及相關(guān)機制。方法:細胞實驗:1、利用不同濃度的丹參酮Ⅰ(TanshinoneⅠ,T-Ⅰ)處理人腎小管上皮細胞(HK-2),利用CCK-8試劑盒檢測各組細胞活力,檢測T-Ⅰ藥物毒性;2、利用不同濃度的H2O2處理HK-2,2h后檢測各組細胞活力,選取構(gòu)建氧化應激模型最佳H2O2濃度;3、丹參酮Ⅰ藥效實驗:設(shè)置4個實驗組,對照組1(control)、對照組2(T-Ⅰ)、模型組1(H2O2)、模型組2(H2O2+T-Ⅰ),利用丹參酮Ⅰ或其溶劑處理24h,然后H2O2組及H2O2+T-Ⅰ組利用過氧化氫處理2h,CCK-8檢測各組細胞活力、流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PⅠ雙染法定量檢測各組細胞凋亡情況;4、通過DCFH-DA法對各組細胞內(nèi)的活性氧水平在熒光顯微鏡下觀察;5、利用RT-qPCR及Western Blot檢測各組細胞中Nrf2及其下游基因表達情況;6、Nrf2敲降之后利用RT-qPCR檢測細胞內(nèi)Nrf2及其下游基因的表達,之后使用Nrf2-的HK-2重復丹參酮Ⅰ藥效實驗,檢測各組細胞活力。動物實驗:1、32只8周雄性ICR小鼠枿機分為4組:假手術(shù)組1(sham),假手術(shù)組2(sham+T-Ⅰ),手術(shù)組1(ⅠR),手術(shù)組2(IR+T-Ⅰ),每組8只,sham+T-Ⅰ組及IR+T-Ⅰ組予以丹參酮Ⅰ腹腔注射兩周,sham組及IR組腹腔注射等量溶劑;2、建立腎臟缺血再灌注模型:手術(shù)組予以游離并夾閉左腎血管50min,切除右腎;假手術(shù)組僅切除右腎,游離左腎血管,不阻斷血供;術(shù)后48h留取各組小鼠左腎組織及血清標本;3、檢測血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平,評估腎臟功能;4、腎臟組織切片HE染色觀察組織形態(tài)學的改變,并進行組織病理學評分;5、檢測各組小鼠腎臟中SOD活力及MDA含量,評估氧化應激狀態(tài);6、通過免疫組化觀察腎臟組織中CD8、IL-6的表達,評估各組小鼠腎臟的炎癥狀態(tài);7、Tunel法檢測各組小鼠腎臟組織細胞凋亡情況;8、利用RT-qPCR及Western Blot檢測各組小鼠腎臟中Nrf2及其下游基因表達情況。結(jié)果:細胞實驗:細胞毒性實驗顯示3.5μM及更低濃度的T-Ⅰ對HK-2沒有細胞毒性,過氧化氫毒性試驗顯示2mM為氧化應激模型最佳處理濃度;T-Ⅰ藥效實驗:T-Ⅰ可顯著減輕H2O2導致的HK-2細胞活力下降并且可以減少H2O2導致的細胞凋亡;DCFA-DA活性氧檢測結(jié)果顯示T-Ⅰ可顯著減少H2O2誘導后的細胞內(nèi)活性氧水平;信號通路研究發(fā)現(xiàn)T-Ⅰ可上調(diào)Nrf2下游相關(guān)基因的mRNA以及蛋白水平,且能夠上調(diào)Nrf2在胞質(zhì)以及胞核的蛋白水平;且Nrf2敲降之后丹參酮Ⅰ不能改善H2O2導致的細胞活力下降。動物實驗:T-Ⅰ可降低IR導致的小鼠血清肌酐、尿素氮升高,改善IR引起的腎臟組織病理學改變,且T-Ⅰ治療組小鼠腎臟炎癥狀態(tài)減輕、細胞凋亡減少;T-Ⅰ預處理可增加IR后腎臟組織內(nèi)SOD活力、降低MDA含量;信號通路研究發(fā)現(xiàn)T-Ⅰ可增加小鼠腎臟內(nèi)Nrf2表達及上調(diào)核內(nèi)Nrf2蛋白水平,并且可明顯上調(diào)小鼠腎臟組織中Nrf2下游基因GCLC、HMOX1、GPX2的mRNA及蛋白水平。結(jié)論:丹參酮Ⅰ可以激活Nrf2-ARE信號通路發(fā)揮抗氧化作用,進而在腎臟缺血再灌注損傷中起到保護作用,為腎臟缺血再灌注損傷提供新的治療策略。
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

實驗結(jié)果逡逑１．邐Ｔ－Ｉ對ＨＫ－２藥物毒性研宄逡逑如圖１．１所示：利用丹參酮Ｉ處理細胞２４ｈ及４８ｈ之后，３．５＾Ｍ以及更逡逑低濃度的丹參酮Ｉ未見明顯毒副作用，（Ｐ＞0．0５），而經(jīng)過４ｐＭ以及更高濃度逡逑的丹參酮Ｉ預處理２４ｈ和４８ｈ之后，ＨＫ－２細胞活力較對照組明顯下降逡逑（Ｐ＜０．０５）；后續(xù)實驗選用丹參酮Ｉ濃度為３ｐＭ。逡逑２４ｈ邐４８ｈ逡逑１．５－１邐１．５－逡逑＾ｌｌＢｉｓｉｉ！。棚ｉｌｉｉ逡逑0０＜＂邐00？逡逑Ｔ－Ｉ邋（ｊｉＷ）邐Ｔ－ｌ邋（ｙＭ）逡逑圖１．１邋Ｔ－Ｉ對ＨＫ－２藥物毒性研宄（＊，與ｃｏｎｔｒｏｌ組相比Ｐ＜０．０５）逡逑２．

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逑３．邐Ｔ－Ｉ減輕Ｈ２0２模擬的氧化應激模型導致的ＨＫ－２細胞活力下降逡逑各組ＨＫ－２細胞活力結(jié)果如圖１．３所示，模型組（Ｈ２0２組及Ｈ２０２＋Ｔ－Ｉ組）細胞逡逑活力較對照組（ｃｏｎｔｒｏｌ組及Ｔ－Ｉ組）顯著下降，而Ｈ２０２＋Ｔ－Ｉ組細胞活力較逡逑Ｈ２Ｏ２組明顯升高（Ｐ＜0．0５）。逡逑１．２－．逡逑１．０－邋｜－Ｉ－｜邐＊逡逑Ｉ０－８－邐＿邐—ｉ逡逑０６＇邐■邐ｔ邋■逡逑”：Ｉ＂逡逑■逡逑0－0Ｍ邋Ｉ邋Ｌ－ｒ逡逑圖１．３邋Ｔ－Ｉ減輕Ｈ２０２導致的細胞活力下降（＊，邋Ｐ＜０．０５）逡逑４．邐Ｔ－丨減輕Ｈ２0２導致的ＨＫ－２細胞凋亡逡逑利用Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩ雙染法檢測各組細胞的凋亡情況，結(jié)果如圖１．４逡逑所示，Ｑ４、Ｑ２分別代表早期及晚期凋亡（圖Ａ），定量結(jié)果顯示Ｈ２０２組細逡逑胞凋亡比例較ｃｏｎｔｒｏｌ組及Ｔ－Ｉ組顯著增加，而Ｈ２０２＋Ｔ－Ｉ組細胞凋亡比例較逡逑Ｈ２Ｏ２組有所下降（Ｐ＜0．0５）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邐邐邋Ｔ－藤邋｜邐邐逡逑２５－１逡逑々邋。，＊逡逑￡２。－邐＿逡逑｜邋ｉｓ－邐■逡逑ｍＣ＇Ａ邐Ｍ逡逑Ｈ，0，邐￣￣Ｉ邋｜Ｈ

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3 高文強;邱雪峰;李凱;陳蔚;趙曉智;李笑弓;郭宏騫;;丹參酮Ⅰ在腎臟缺血再灌注損傷中的保護作用研究[J];東南大學學報(醫(yī)學版);2018年03期

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本文編號：2790315