【摘要】：檳榔(Arecae Semen)是棕櫚科(Palmae)植物檳榔Areca catechu L.的干燥成熟種子,傳統(tǒng)功效為驅(qū)蟲、消積、行氣、利水和截瘧。中醫(yī)傳統(tǒng)臨床應(yīng)用認(rèn)為檳榔炒焦后“長于消食導(dǎo)滯”,然而目前缺乏系統(tǒng)的藥效學(xué)證據(jù),尚停留在傳統(tǒng)應(yīng)用共識的層面;此外,當(dāng)前也缺乏檳榔炒焦“長于消食導(dǎo)滯”的炮制機(jī)制和相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。近年來,研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)檳榔堿有一定的毒性,然而目前對于檳榔藥材飲片及其炮制品的質(zhì)量控制往往只注重檳榔堿的最低含量而忽視其最高限量。目的:系統(tǒng)研究檳榔炒焦前后的成分變化(包括還原性單糖及低聚糖、氨基酸、美拉德產(chǎn)物和多糖),并結(jié)合“高效液相色譜(HPLC)-促胃腸動力活性”譜-效關(guān)系的研究,初步闡明檳榔炒焦“長于消食導(dǎo)滯”的炮制機(jī)制。以“目標(biāo)成分去除”結(jié)合生物活性評價的思路,篩選檳榔堿在焦檳榔飲片中的適宜含量,為焦檳榔飲片的合理炮制工藝及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.采用“在線非接觸紅外測溫系統(tǒng)”實(shí)時監(jiān)測炒藥機(jī)中藥材的溫度變化,以自動控溫炒藥機(jī)制備檳榔炒制樣品,為后續(xù)的檳榔炒焦“長于消食導(dǎo)滯”炮制機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)樣品。2.通過離體和整體動物模型,比較生檳榔和焦檳榔對大鼠胃腸平滑肌張力及小鼠胃腸運(yùn)動的作用,并以阿托品所致的胃腸運(yùn)動遲緩小鼠模型進(jìn)一步評價,以驗(yàn)證檳榔炒焦“長于消食導(dǎo)滯”。3.以HPLC法比較檳榔炒焦前后化學(xué)成分變化,以制備HPLC(PHPLC)技術(shù)分離檳榔炒焦后新產(chǎn)生的化學(xué)成分,通過1H-NMR和13C-NMR技術(shù)鑒定新產(chǎn)生的成分;比較檳榔炒焦前后氨基酸和還原性單糖的變化,分析新產(chǎn)生成分可能的生成機(jī)制;以響應(yīng)面法優(yōu)化檳榔多糖的提取工藝,比較檳榔炒焦前后多糖含量的變化;基于HPLC指紋圖譜和腸平滑肌張力,采用SPSS軟件及雙變量相關(guān)法分析16批檳榔炒制樣品“HPLC譜-促胃腸動力”譜-效關(guān)系。4.以制備TLC色譜技術(shù)(PTLC)制備“檳榔堿完全去除的焦檳榔提取物(WAC-100R,R意思是去除檳榔堿)”;并通過焦檳榔提取物(WAC)和WAC-100R的組合制備“一系列的檳榔堿不同程度去除的焦檳榔提取物(WAC-Rx)”。5.采用急性毒性實(shí)驗(yàn),評價WAC-Rx[WAC、WAC-30R(意思是“去除了30%檳榔堿的焦檳榔提取物”)、WAC-50R和WAC-100R]對小鼠的半數(shù)致死量(LD50);以MTT法考察WAC-Rx(WAC、WAC-10R、WAC-20R、WAC-30R、WAC-40R、WAC-50R、WAC-60R、WAC-70R、WAC-80R、WAC-90R和WAC-100R)對上皮細(xì)胞(Ha Ca T細(xì)胞)的細(xì)胞毒性;以離體和整體動物模型評價WAC-Rx(WAC、WAC-30R、WAC-50R和WAC-100R)對大鼠離體胃腸平滑肌張力及小鼠胃腸運(yùn)動的影響,并通過阿托品所致的胃腸運(yùn)動遲緩小鼠模型進(jìn)一步確證。6.以流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞DAPI染色實(shí)驗(yàn)比較WAC-Rx(WAC、WAC-30R、WAC-50R和WAC-100R)誘導(dǎo)Ha Ca T細(xì)胞凋亡的作用;以western blot法比較WAC-Rx(WAC、WAC-30R、WAC-50R和WAC-100R)對凋亡蛋白(Caspase-3)、原癌基因(c-fos和c-jun)和促炎癥因子(COX-2、PGE2和IL-1α)在Ha Ca T細(xì)胞中表達(dá)的影響。結(jié)果:1.焦檳榔與生檳榔提取物均能顯著提高大鼠離體胃腸平滑肌張力;和生檳榔相比,在濃度高于10μg/m L時,焦檳榔具有更強(qiáng)的增強(qiáng)胃腸平滑肌條張力的作用。在體動物實(shí)驗(yàn)表明,焦檳榔和生檳榔均能顯著增強(qiáng)小鼠胃排空和腸推進(jìn),其中以焦檳榔為佳;硫酸阿托品造模的動物實(shí)驗(yàn)也表明焦檳榔和生檳榔均能改善模型小鼠胃腸運(yùn)動,但焦檳榔作用更強(qiáng)。2.應(yīng)用PHPLC技術(shù),成功分離得到檳榔炒焦后新產(chǎn)生的3個成分,分別鑒定為:2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyranone(DDMP)、5-Hydroxymethyl-2-furfural(5-HMF)和3-hydroxy-2-methyl-γ-pyrone(Maltol)。檳榔炒焦后氨基酸含量顯著降低(降低程度為:精氨酸賴氨酸脯氨酸絲氨酸)、還原性糖(包括:葡萄糖、果糖)含量也有明顯的下降、p H值下降而A420值增高,表明檳榔在炒焦的炮制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng),新產(chǎn)生這3個的化合物為美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物。3.基于響應(yīng)面法,本文優(yōu)化了檳榔多糖的提取工藝,并比較了檳榔炒焦前后多糖的含量及其單糖組成和分子量分布等方面變化。結(jié)果表明:檳榔炒焦后水提液中多糖含量明顯增高;多糖的單糖組成變化不明顯但是比例有明顯變化。4.實(shí)驗(yàn)測定了16批檳榔炒制樣品(40μg/m L)對腸平滑肌張力的作用以及相應(yīng)的HPLC指紋圖譜�！白V效關(guān)系”研究表明:16批檳榔炒制樣品共有14個特征峰,有5個共有特征峰與腸平滑肌張力均呈現(xiàn)正相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,特別是3個美拉德產(chǎn)物與十二指腸平滑肌張力密切相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:DDMP(相關(guān)系數(shù):0.872,p0.01)、5-HMF(相關(guān)系數(shù):0.843,p0.01)和Maltol(相關(guān)系數(shù):0.782,p0.01)。5.采用三氯甲烷(CHCl3)萃取得到焦檳榔總生物堿(TAE),以PTLC去除TAE中檳榔堿,并成功制備WAC-100R以及WAC-Rx(WAC-10R、WAC-20R、WAC-30R、WAC-40R、WAC-50R、WAC-60R、WAC-70R、WAC-80R和WAC-90R)。6.WAC對于Ha Ca T細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性,其半數(shù)抑制濃度(IC50)為107.73μg/m L。去除50%的檳榔堿后(WAC-50R~WAC-100R),其細(xì)胞毒性顯著降低(IC50400μg/m L)。另外,WAC灌胃對小鼠有一定的毒性,其LD50為15.302 g/kg;去除50%后的檳榔堿的WAC-Rx(WAC-50R和WAC-100R)未觀察到明顯的毒性。和WAC相比,檳榔堿去除不高于50%的WAC-Rx(WAC-30R和WAC-50R)對胃腸平滑肌張力和胃腸運(yùn)動(胃排空和腸推進(jìn))的作用不會有明顯的降低。7.與WAC組對比,WAC-50R和WAC-100R導(dǎo)致的Ha Ca T細(xì)胞凋亡顯著減弱,且誘導(dǎo)的Caspase-3、c-jun、c-fos、COX-2、PGE2和IL-1α在Ha Ca T細(xì)胞中的表達(dá)也明顯低于WAC組。8.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明去除原焦檳榔50%檳榔堿可進(jìn)一步降低其副作用且能保證“消食導(dǎo)滯”的作用。本次采用的焦檳榔飲片中檳榔堿含量約0.239%,因此我們認(rèn)為0.12%是焦檳榔中檳榔堿的適宜含量。結(jié)論:檳榔炒焦“長于消食導(dǎo)滯”的炮制機(jī)制與以下三方面相關(guān):(1)檳榔堿在一定的劑量內(nèi)表現(xiàn)出明顯的促胃腸動力活性,炒焦除去了一部分檳榔堿而使其在焦檳榔中的含量更合理;(2)檳榔炒焦過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng),其新產(chǎn)生的美拉德產(chǎn)物(如DDMP、5-HMF和Maltol等)與檳榔炒焦“消食導(dǎo)滯”作用增強(qiáng)密切相關(guān);(3)多糖可能也是檳榔“消食導(dǎo)滯”的效應(yīng)物質(zhì),炒焦可使檳榔多糖成分更利于溶出和提取。本研究提示焦檳榔中檳榔堿的適宜含量約為0.12%;“目標(biāo)成分去除”結(jié)合活性評價的策略可用于研究毒性成分在中藥飲片中的適宜含量,有利于制定合理的中藥飲片炮制工藝規(guī)范及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。創(chuàng)新點(diǎn):1.本課題首次研究了檳榔炒制樣品的“HPLC-促胃腸運(yùn)動活性”譜效關(guān)系,發(fā)現(xiàn)檳榔炒制品促進(jìn)胃腸運(yùn)動的作用與炮制過程中產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(如:DDMP、5-HMF和Maltol等)密切相關(guān)。2.本課題通過實(shí)驗(yàn)研究初步闡明了檳榔炒焦后“消食導(dǎo)滯”作用增強(qiáng)的炮制機(jī)制,為檳榔炒焦“長于消食導(dǎo)滯”提供了一定的科學(xué)依據(jù)。3.本次研究首次以“目標(biāo)成分去除”結(jié)合活性評價的策略,研究了焦檳榔中檳榔堿的適宜含量。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)檳榔堿在焦檳榔中較適宜含量約為0.12%。本次研究為焦檳榔炮制工藝中檳榔堿的含量控制提供一定的科學(xué)依據(jù),也為其他有毒成分在中藥飲片中的含量限度研究提供新的思路,有利于制定合理的中藥飲片炮制工藝規(guī)范及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R283
【圖文】：

圖 1-1. 生檳榔和焦檳榔對小鼠胃 (A)、腸 (B)離體平滑肌張力的影響.NS：生理鹽水，AN：生檳榔，CAN：焦檳榔；**p < 0.01, *p < 0.05 vs. NS;##p < 0.01 vs. AN.Figure 1-1. Effects of areca nut (AN) and charred areca nut (CAN) on gastric (A) andintestinal (B) smooth muscle contraction in vitro.3.2 生檳榔和焦檳榔對小鼠胃排空和腸推進(jìn)的作用如圖 1-2 所示，焦檳榔樣品（CAN，50，100 和 200 mg/kg）均能顯著增加小鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率（p < 0.05，p < 0.01 和 p < 0.01）；生檳榔樣品（AN，50，100 和 200mg/kg）也表現(xiàn)出明顯的增加胃排空率和小腸推進(jìn)率的作用（p < 0.05，p < 0.01，p < 0.01）。和生檳榔組相比，焦檳榔樣品（100 和 200 mg/kg）則表現(xiàn)出更強(qiáng)的促進(jìn)胃排空和腸推進(jìn)的作用（p < 0.05）。

圖 1-2. 生檳榔和焦檳榔對小鼠胃排空（A）和腸推進(jìn)（B）的影響.AN：生檳榔，CAN：焦檳榔；**p < 0.01, *p < 0.05 vs. control;#p < 0.05 vs. AN.Figure 1-2. Effects of areca nut (AN) and charred areca nut (CAN) on gastric emptying (A)and intestinal transit (B) of normal mice.3.3 生檳榔和焦檳榔對阿托品所致胃腸功能遲緩小鼠模型胃腸運(yùn)動的影響根據(jù) 3.2 的結(jié)果，我們選擇 200 mg/kg 的檳榔提取物進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。如圖 1-3所示，硫酸阿托品腹腔注射造模后，小鼠胃腸運(yùn)動明顯減弱（p < 0.01）。給予樣品后（200mg/kg），生檳榔組（AN）和焦檳榔組（CAN）小鼠胃腸運(yùn)動顯著增強(qiáng)（p < 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，和生檳榔組相比，焦檳榔樣品對硫酸阿托品所致的小鼠胃腸功能遲緩具有更強(qiáng)的改善作用（p < 0.05）。

圖 1-3. 生檳榔和焦檳榔對硫酸阿托品所致胃腸功能遲緩模型小鼠胃排空（A）和腸推進(jìn)（B）的影響.AN：生檳榔，CAN：焦檳榔；**p < 0.01, *p < 0.05 vs. Control; #p < 0.05 vs. AN.Figure 1-3. Effects of areca nut (AN) and charred areca nut (CAN) on gastric emptying (A)and intestinal transit (B) of atropine sulphate treated mice.4 結(jié)論本節(jié)實(shí)驗(yàn)通過離體和在體動物模型系統(tǒng)比較了生檳榔和焦檳榔對進(jìn)胃腸運(yùn)動的作用。本次研究表明，生檳榔和焦檳榔提取物均能明顯的促進(jìn)胃腸運(yùn)動，而且以焦檳榔為佳。本次實(shí)驗(yàn)采用阿托品所致的小鼠胃腸運(yùn)動遲緩模型[23]進(jìn)一步驗(yàn)證檳榔的“長于消食導(dǎo)滯”的特性，研究結(jié)果同樣表明生檳榔和焦檳榔都能顯著改善模型小鼠胃腸運(yùn)動，并且焦檳榔比生檳榔更有優(yōu)勢。

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5 萬啟華;足

本文編號：2789268