麝香化合物活化人類嗅覺受體的分子機制研究
發(fā)布時間：2020-08-09 12:27
【摘要】：麝香化合物被廣泛的應用于香料工業(yè)和傳統(tǒng)醫(yī)藥,已有2000多年悠久的歷史。然而對于麝香嗅覺受體(odorant receptor,OR)活化機制的研究鮮有報道,因為到目前為止,由于缺乏嗅覺受體的晶體學模型,使得在分子水平上了解嗅覺受體的活化機制成為該領域的挑戰(zhàn)之一。本課題結合生物學實驗和計算生物學模型對麝香類化合物活化人類嗅覺受體的機制進行綜合分析。我們借助嗅覺受體的異源表達體系,篩選得到兩個麝香嗅覺受體OR5AN1和OR1A1,接著檢測它們對大環(huán)麝香、硝基麝香、多環(huán)麝香這三類合成麝香以及結構類似物的反應譜,并對OR5AN1的配體進行篩選以研究嗅覺受體對氣味配體反應的特異性和選擇性。結果顯示OR5AN1是一個高度特異性的人類麝香嗅覺受體,能被大環(huán)麝香和硝基麝香活化,硝基麝香的反應活性普遍優(yōu)于大環(huán)麝香,其中納摩爾級的酮麝香就能有效活化OR5AN1。此外,OR5AN1對部分環(huán)狀亞砜化合物以及氟化的環(huán)酮也有反應活性,而OR1A1僅與硝基麝香反應。通過檢測OR5AN1對一系列含氟麝香酮結構類似物的反應情況,并對相應的氟化衍生物的X射線結構進行解析,最終對其與OR5AN1反應的優(yōu)勢構象進行分析和描述。我們利用同源模建、量子力學/分子力學(quantum mechanics/molecular mechanics,QM/MM)和分子動力學模擬的方法構建了OR5AN1和OR1A1的結構模型,并對相關麝香化合物結合能加以分析并運用定點突變實驗對該模型進行評估。結構模型顯示OR5AN1上的第六跨膜區(qū)的260位的酪氨酸殘基與相應麝香配體形成氫鍵相互作用,其結合口袋周圍的疏水氨基酸殘基105、194和207位的苯丙氨酸與配體形成疏水相互作用。另外,OR1A1則通過其第六跨膜區(qū)的258位的酪氨酸殘基與硝基麝香配體形成氫鍵,251位酪氨酸和206位的苯丙氨酸提供疏水相互作用�；谠拥娜S定量構效關系(quantitative structure activity relationship,QSAR)模型顯示輸水相互作用和氫鍵作用分別對氣味分子與受體相互作用有77%和13%的貢獻。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：
當揮發(fā)性的氣味分子進入鼻腔后，被特異性的嗅覺受體識別和結合，導致與嗅覺受體偶聯(lián)的 G 蛋白（Golf）活化并脫離，進一步激活腺苷酸環(huán)化酶 III（type IIIadenylyl cyclase，ACIII），使細胞內第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）增加，Ca+和 Na+通過被 cAMP 激活的環(huán)核苷酸門控通道（cyclic nucleotide-gated channel，CNGC）內流進入細胞內，使膜去極化產(chǎn)生動作電位[3]，從而把氣味分子的化學信號轉變?yōu)殡娦盘�，該電信號通過神經(jīng)元軸突傳遞到嗅球，信息到達嗅球中的不同嗅小球（glomerulus），在嗅小球交換神經(jīng)元，再傳遞給帽狀細胞（mitral cell）。信息在嗅球中經(jīng)過處理后，形成空間和時間的編碼，編碼后的信息傳達至大腦皮層中的嗅覺中樞，最終形成不同的氣味嗅覺感知[4, 5]（圖 1）。在嚙齒類動物體內還存在另外一套嗅覺系統(tǒng)，即犁鼻系統(tǒng)（vomeronasal system，VNS）。一般認為一些非揮發(fā)性的大分子化學物質被犁鼻系統(tǒng)中的犁鼻器（vomeronasal organ，VNO）識別，如信息素等[6]。
圖 2：小鼠嗅球前背內側的嗅小球參與麝香酮的特異性應答。Figure 2：Anterodorsomedial glomeruli in the mouse OB respond to muscone.摘自[58]六、論文的主要研究內容帶著上述問題，本課題在之前針對麝香嗅覺受體的研究發(fā)現(xiàn)的基礎上，篩選多個不同類別的麝香分子的嗅覺受體，得到了 OR5AN1 和 OR1A1 這兩個人類麝香嗅覺受體，并檢測它們對不同結構和類別的麝香化合物及其結構類似物的反應譜，研究嗅覺受體對氣味配體反應的特異性和選擇性。借助構象不同的一系列氟化麝香酮衍生物，對其與 OR5AN1 反應的優(yōu)勢構象進行分析和描述。麝香具有藥用和工業(yè)雙重價值，在香料及中醫(yī)藥領域的應用已經(jīng)有 2000 多年的悠久歷史，然而對于麝香嗅覺受體活化機制的研究鮮有報道，因為到目前為止，
胞數(shù)、細胞健康程度、轉染效率和非特異性細胞反應對結果的影響，使主報告基因的結果歸一化，有效規(guī)避假陽性或者假陰性結果。其檢測原理示意圖如圖所示（圖3）。圖3：雙熒光素酶報告基因實驗（Dual-Glo luciferase assay）檢測嗅覺受體功能的原理示意圖。Figure 3：A schematic diagram of the Dual-Glo luciferase assay to examine the odorant receptorresponse.摘自[68]雙熒光素酶報告基因實驗的操作步驟如下：1. 種細胞：用胰酶消化處理Hana3A細胞，200 x g離心5min，加入適量M10培養(yǎng)液（含10%FBS的MEM）重懸，每塊96板需要的細胞總數(shù)為2×106，或者約為100mm培養(yǎng)皿鋪滿時細胞總量的20%，將細胞接種于96孔板（Greiner）中，培養(yǎng)過夜。2. 轉染：觀察和確認細胞狀態(tài)正常，每個孔內的細胞密度為30%-50%
本文編號：2787117
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：
當揮發(fā)性的氣味分子進入鼻腔后，被特異性的嗅覺受體識別和結合，導致與嗅覺受體偶聯(lián)的 G 蛋白（Golf）活化并脫離，進一步激活腺苷酸環(huán)化酶 III（type IIIadenylyl cyclase，ACIII），使細胞內第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosinemonophosphate，cAMP）增加，Ca+和 Na+通過被 cAMP 激活的環(huán)核苷酸門控通道（cyclic nucleotide-gated channel，CNGC）內流進入細胞內，使膜去極化產(chǎn)生動作電位[3]，從而把氣味分子的化學信號轉變?yōu)殡娦盘�，該電信號通過神經(jīng)元軸突傳遞到嗅球，信息到達嗅球中的不同嗅小球（glomerulus），在嗅小球交換神經(jīng)元，再傳遞給帽狀細胞（mitral cell）。信息在嗅球中經(jīng)過處理后，形成空間和時間的編碼，編碼后的信息傳達至大腦皮層中的嗅覺中樞，最終形成不同的氣味嗅覺感知[4, 5]（圖 1）。在嚙齒類動物體內還存在另外一套嗅覺系統(tǒng)，即犁鼻系統(tǒng)（vomeronasal system，VNS）。一般認為一些非揮發(fā)性的大分子化學物質被犁鼻系統(tǒng)中的犁鼻器（vomeronasal organ，VNO）識別，如信息素等[6]。
圖 2：小鼠嗅球前背內側的嗅小球參與麝香酮的特異性應答。Figure 2：Anterodorsomedial glomeruli in the mouse OB respond to muscone.摘自[58]六、論文的主要研究內容帶著上述問題，本課題在之前針對麝香嗅覺受體的研究發(fā)現(xiàn)的基礎上，篩選多個不同類別的麝香分子的嗅覺受體，得到了 OR5AN1 和 OR1A1 這兩個人類麝香嗅覺受體，并檢測它們對不同結構和類別的麝香化合物及其結構類似物的反應譜，研究嗅覺受體對氣味配體反應的特異性和選擇性。借助構象不同的一系列氟化麝香酮衍生物，對其與 OR5AN1 反應的優(yōu)勢構象進行分析和描述。麝香具有藥用和工業(yè)雙重價值，在香料及中醫(yī)藥領域的應用已經(jīng)有 2000 多年的悠久歷史，然而對于麝香嗅覺受體活化機制的研究鮮有報道，因為到目前為止，
胞數(shù)、細胞健康程度、轉染效率和非特異性細胞反應對結果的影響，使主報告基因的結果歸一化，有效規(guī)避假陽性或者假陰性結果。其檢測原理示意圖如圖所示（圖3）。圖3：雙熒光素酶報告基因實驗（Dual-Glo luciferase assay）檢測嗅覺受體功能的原理示意圖。Figure 3：A schematic diagram of the Dual-Glo luciferase assay to examine the odorant receptorresponse.摘自[68]雙熒光素酶報告基因實驗的操作步驟如下：1. 種細胞：用胰酶消化處理Hana3A細胞，200 x g離心5min，加入適量M10培養(yǎng)液（含10%FBS的MEM）重懸，每塊96板需要的細胞總數(shù)為2×106，或者約為100mm培養(yǎng)皿鋪滿時細胞總量的20%，將細胞接種于96孔板（Greiner）中，培養(yǎng)過夜。2. 轉染：觀察和確認細胞狀態(tài)正常，每個孔內的細胞密度為30%-50%
【參考文獻】
相關期刊論文 前1條
1 劉宇紅，熊培文，王振川，李會勇，倫玉敏，熊偉;異色滿類香料化合物的合成及其進展[J];精細化工;1994年06期
本文編號：2787117
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