【摘要】：目的:采用藥理學(xué),病理學(xué),分子生物學(xué),電鏡等多種科研技術(shù)與方法,以探討復(fù)方蛇龍膠囊降低大鼠腎性蛋白尿及對(duì)足細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。方法:以72只SPF級(jí)健康雄性大鼠為研究對(duì)象,隨機(jī)取12只作為正常對(duì)照組,其余60只應(yīng)用兩次尾靜脈注射阿霉素(ADR)的方法建立腎性蛋白尿的動(dòng)物模型,經(jīng)檢測(cè)尿蛋白定量大于100 mg/24h者模型復(fù)制成功,隨機(jī)分為模型組,陽(yáng)性對(duì)照藥組(雷公藤組)、復(fù)方蛇龍膠囊低、中、高劑量組。各組分別予灌胃給藥,灌胃體積為2 ml/100g·d,雷公藤組以成人臨床用量的5倍,即5 mg/kg·d作為大鼠給藥劑量;低劑量組以成人臨床藥量的3.75倍(即相當(dāng)于生藥0.375 g/kg·d)作為大鼠給藥劑量,中劑量組為成人臨床藥量7.5倍(相當(dāng)于生藥0.75 g/kg·d)作為大鼠給藥劑量,高劑量組為成人臨床藥量15倍(相當(dāng)于生藥1.5 g/kg·d)作為大鼠給藥劑量,正常組與模型組給予等體積的生理鹽水。分別檢測(cè)大鼠給藥0周、2周、4周、6周、8周的24小時(shí)尿蛋白排泄量;連續(xù)給藥4周,每組隨機(jī)抽取大鼠6只,測(cè)定血漿總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯等生化指標(biāo),同時(shí)對(duì)腎皮質(zhì)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;各組剩余大鼠繼續(xù)給藥至8周,依上法檢測(cè)上述指標(biāo)。以條件永生代小鼠腎足細(xì)胞MPC5為研究對(duì)象,利用CCK-8試劑盒的方法篩選ADR的造模劑量及復(fù)方蛇龍膠囊的試驗(yàn)劑量。分別在干預(yù)完成后,檢測(cè)各組相關(guān)指標(biāo):利用RT-PCR和Western blot分別從基因和蛋白的水平檢測(cè)足細(xì)胞特異性蛋白nerphrin、podocin、synaptopodin及凋亡因子cyt-C、caspase9、caspase3;在蛋白層面檢測(cè)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的表達(dá)水平;利用雙抗體夾心法檢測(cè)cAMP的水平;利用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡;利用Jc-1試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位的變化;利用比色法檢測(cè)ATP水平;利用透射電鏡對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果:1.復(fù)方蛇龍膠囊可顯著降低大鼠24 h蛋白尿排泄量,升高血漿總蛋白和白蛋白,降低總膽固醇和甘油三酯。同時(shí),形態(tài)學(xué)觀察表明:光鏡下,正常組大鼠GBM結(jié)構(gòu)完整,基質(zhì)及系膜細(xì)胞未見(jiàn)增生。給藥組與模型組相比,足細(xì)胞輕微腫脹,基質(zhì)及系膜細(xì)胞可見(jiàn)輕度增生,腎小管管腔內(nèi)可見(jiàn)少量蛋白管型,間質(zhì)有輕微炎性細(xì)胞侵潤(rùn);電鏡下,空白組大鼠GBM完整平滑,無(wú)系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,足突排列整齊,無(wú)融合,給藥組優(yōu)于模型組,其基質(zhì)及系膜細(xì)胞增生較輕,僅見(jiàn)少量足突融合,腎小管細(xì)胞水腫較輕,線粒體腫脹變性程度較少,溶酶體減少。2.ADR造模劑量為0.25μg/ml,干預(yù)時(shí)間為24 h;確立復(fù)方蛇龍膠囊高中低劑量組,分別為100 ng/ml,75 ng/ml,50 ng/ml,干預(yù)時(shí)間為24 h。3.復(fù)方蛇龍膠囊可上調(diào)足細(xì)胞相關(guān)特異性因子nerphrin、podocin、synaptopodin基因水平及蛋白水平,抑制凋亡因子cyt-C、caspase9、caspase3基因水平及蛋白水平,抑制細(xì)胞凋亡,上調(diào)cAMP水平,減輕線粒體膜電位的下調(diào),提高ATP水平。形態(tài)學(xué)觀察表明:透射電鏡下,給藥組足細(xì)胞較模型組線粒體腫脹程度較輕,線粒體嵴排列紊亂程度較輕,溶酶體破裂程度較輕,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒程度減輕,核固縮程度較輕。結(jié)論:1.復(fù)方蛇龍膠囊可有效降低大鼠腎性蛋白尿的排泄量。2.復(fù)方蛇龍膠囊降低蛋白尿及對(duì)足細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP水平,調(diào)節(jié)下游蛋白CREB磷酸化,一方面維持足細(xì)胞特異性蛋白nerphrin、podocin、synaptopodin水平,另一方面維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能,抑制細(xì)胞凋亡,抑制線粒體膜電位的降低,提高ATP的含量而達(dá)到保護(hù)足細(xì)胞的作用,繼而維護(hù)了濾過(guò)屏障的完整性,減輕蛋白漏出,從而達(dá)到降低蛋白尿的目的。
【學(xué)位授予單位】：山西省中醫(yī)藥研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2786675