【摘要】：目的:通過建立大鼠Langendroff離體心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型以及在體心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型,進(jìn)行錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷的藥效學(xué)研究,并在明確錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷作用的基礎(chǔ)上,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測,并運(yùn)用Western blotting方法對其作用機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。方法:1.錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷藥效學(xué)研究SD大鼠72只,隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組(鹽酸維拉帕米注射液,給藥劑量為5×10~(-7)mol/L)、錦鶴養(yǎng)心方總黃酮高、中、低劑量組(給藥劑量分別為16、8、4mg/L)6組,每組12只。實(shí)驗(yàn)前各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,制備離體大鼠心臟,采用langendorff離體心臟灌流,連接ML870型8通道生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng),通過對大鼠離體心臟進(jìn)行平衡20min,停灌30min,復(fù)灌60min處理,建立離體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,復(fù)灌時(shí)除正常組和模型組外其他各給藥組分別以三個(gè)不同濃度的錦鶴養(yǎng)心方總黃酮、鹽酸維拉帕米注射液進(jìn)行灌注,觀察平衡期、復(fù)灌末期各組大鼠HR(心率)、+dp/dt _(max)(左心室內(nèi)壓最大上升速率)、-dp/dt _(max)(左心室內(nèi)壓最大下降速率)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化;復(fù)灌結(jié)束后,從灌注裝置上取下心臟,切取左心室固定于4%多聚甲醛組織固定液中,用HE染色法觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。SD大鼠72只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥組(復(fù)方丹參滴丸,給藥劑量為0.081g·kg~(-1))、錦鶴養(yǎng)心方總黃酮高、中、低劑量組(給藥劑量分別為2,1,0.5g·kg~(-1))6組,每組12只。各組大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,連續(xù)灌胃給藥14 d,給藥體積均為2 mL/100g,每天給藥1次,末次給藥2小時(shí)后造模。通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支,建立大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型,I/R時(shí)段為30min/2h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹主動(dòng)脈取血,靜置30 min后離心(4°C,3000 r·min~(-1),15 min),取上清放入-80°C冰箱凍存,用于測定血清學(xué)指標(biāo)乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量及活性;取血后留取心臟,用TTC染色法進(jìn)行心肌梗死面積的測定;剪取結(jié)扎線以下的左心室部分組織,用HE染色法進(jìn)行心肌組織病理形態(tài)學(xué)的測定。取左心室部分組織,置于-80°C冰箱凍存。2.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷作用機(jī)制研究查閱相關(guān)文獻(xiàn),收集錦鶴養(yǎng)心方組方藥材地錦草、仙鶴草、分心木黃酮類化學(xué)成分,并以“類藥五原則”篩選潛在的活性成分,采用PharmMapper服務(wù)器反向藥效團(tuán)匹配方法預(yù)測活性成分潛在作用靶點(diǎn),并根據(jù)OMIM等數(shù)據(jù)庫中與心肌缺血再灌注相關(guān)的靶點(diǎn),篩選錦鶴養(yǎng)心方黃酮類成分抗心肌缺血再灌注損傷的作用靶標(biāo),通過對靶標(biāo)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析,并構(gòu)建活性成分、抗心肌缺血再灌注損傷作用靶點(diǎn)及通路之間的網(wǎng)絡(luò)圖,探討錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。運(yùn)用Western blotting方法檢測左心室組織中TLR-4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)水平,對TLR4-NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:1.錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷藥效學(xué)研究離體心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中,血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示,錦鶴養(yǎng)心方總黃酮高、中、低劑量組均可提高大鼠離體心肌缺血再灌注末期的HR、+dp/dt _(max)、-dp/dt _(max)水平;HE染色結(jié)果顯示錦鶴養(yǎng)心方總黃酮各劑量組可以明顯改善心肌缺血再灌注造成的心肌病理損傷。在體心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中,血清學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示錦鶴養(yǎng)心方總黃酮不同劑量組均可顯著改善在體大鼠缺血再灌注所致的心肌功能損傷,減少LDH、CK-MB、MDA、IL-6、TNF-α的水平,增加SOD的活性;TTC染色結(jié)果顯示錦鶴養(yǎng)心方總黃酮各劑量組可以明顯減小大鼠的心肌梗死面積;HE染色結(jié)果顯示錦鶴養(yǎng)心方總黃酮各劑量組可以使心肌細(xì)胞病理損傷得到明顯改善。2.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷作用機(jī)制研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析共獲得錦鶴養(yǎng)心方潛在的黃酮類活性成分9個(gè),預(yù)測成分作用靶標(biāo)共95個(gè),篩選出與抗心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)48個(gè),KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)錦鶴養(yǎng)心方總黃酮抗心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制可能與Toll-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway等信號(hào)通路有關(guān)。Western blotting結(jié)果顯示錦鶴養(yǎng)心方總黃酮可使心肌缺血再灌注損傷組織中TLR-4、MyD88、p-NF-κB、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白的表達(dá)水平降低。結(jié)論:錦鶴養(yǎng)心方總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,且該作用與其調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2786336