【摘要】：目的:1)探討巴戟天多糖修復(fù)精索靜脈曲張所致下丘腦-垂體-睪丸軸損傷的作用和機制;2)探究血管加壓素(AVP)能否直接影響促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元合成和分泌活性。內(nèi)容:1)自主提取巴戟天粗多糖,觀察其對精索靜脈曲張睪丸形態(tài)、血管發(fā)生及下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌的作用;2)組織水平觀察血管加壓素直接作用于GnRH神經(jīng)元的證據(jù),細(xì)胞水平檢測AVP對GnRH合成和分泌活性的影響。方法:1)水提醇沉法提取巴戟天粗多糖,并采用紫外、紅外光譜,凝膠滲透色譜(HPGPC)和單糖衍生化分析其基本信息;2)建立實驗性左精索靜脈曲張(ELV)SD大鼠模型,術(shù)后給予巴戟天粗多糖灌胃給藥5周;GT1-7細(xì)胞用于體外研究含藥血清或AVP對GnRH神經(jīng)元的作用;3)采用蘇木素-伊紅(HE)染色、尼氏染色、高爾基染色等研究睪丸和下丘腦基本形態(tài)特征;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清GnRH、AVP、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和睪酮(T)水平;采用免疫熒光組織化學(xué)染色、免疫印跡和實時熒光定量PCR(q-PCR)等檢測組織和細(xì)胞蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄情況;4)觀察生殖障礙大鼠尿/水比、血壓、血清和下丘腦AVP與GnRH的相關(guān)變化,尋找二者共變的相關(guān)性;采用鄰位連接(PLA)和免疫電鏡觀察AVP與GnRH的共定位;采用蛋白組學(xué)初步探索AVP對GnRH神經(jīng)元的作用;q-PCR和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase)檢測GnRH轉(zhuǎn)錄活性及啟動子活性的變化;同時進行細(xì)胞毒性實驗、細(xì)胞周期檢測、細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)測定和ATP檢測以觀察AVP對GnRH神經(jīng)元的作用。結(jié)果:1)本實驗采用的巴戟天粗多糖中碳水化合物含量達(dá)91%;紫外光譜未見明顯蛋白或核酸污染;紅外光譜可見多糖特征性吸收峰;HPGPC示一高尖的主峰,數(shù)均分子量(Mn)1141 Daltons,重均數(shù)均比Mw/Mn 1.444;化學(xué)構(gòu)成為葡萄糖:半乳糖:木糖:果糖:麥芽糖:蔗糖=7.63:1.23:0.95:0.72:0.87:0.64。2)與ELV組比較,50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖顯著修復(fù)ELV大鼠性行為能力,提高雙側(cè)附睪精子計數(shù),降低精子畸形率(P0.05);50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖顯著升高ELV大鼠血清GnRH、FSH、LH和T水平(P0.05),修復(fù)雙側(cè)睪丸生精上皮結(jié)構(gòu),減少生精細(xì)胞異常凋亡,減輕間質(zhì)水腫和血管增生(P0.05);100mg/kg巴戟天粗多糖修復(fù)患側(cè)睪丸效果優(yōu)于50mg/kg,且相對上調(diào)血管生成因子VEGF和MMPs表達(dá)水平(P0.05);50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖顯著增加ELV大鼠下丘腦Arc神經(jīng)元樹突棘密度(P0.05),增加功能性樹突棘數(shù)量(P0.05);50 mg/kg-100 mg/kg巴戟天粗多糖顯著上調(diào)下丘腦Kiss1-GPR54系統(tǒng)表達(dá)水平,增加下丘腦GnRH轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平(P0.05);50 mg/kg-100mg/kg巴戟天粗多糖治療的ELV大鼠血清能促進GT1-7細(xì)胞GnRH合成和分泌(P0.05),上調(diào)GPR54和Oct-1、SCIP水平(P0.05),促MAPKs磷酸化(P0.05)。3)實驗性精索靜脈曲張大鼠隨疾病進展,尿量增多(P0.05),血壓下降(P0.05),血清和下丘腦GnRH和AVP顯著降低(P0.05),且AVP降低幅度較GnRH更早,更明顯(P0.05);在大鼠下丘腦弓狀核檢測到GnRH-AVP PLA陽性信號,免疫電鏡也在該部位同一神經(jīng)末梢內(nèi)同時觀察到GnRH和AVP陽性物;50-200 pg/ml AVP處理6h,GT1-7細(xì)胞內(nèi)ATP和Ca~(2+)水平顯著增高(P0.05),GnRH轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P0.05),GnRH啟動子活性顯著增高(P0.05),細(xì)胞內(nèi)GnRH相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct-1和SCIP水平也顯著增高(P0.05),Erk1/2和p38磷酸化水平顯著增高(P0.05);1000pg/ml以上AVP無刺激GnRH合成和分泌的表現(xiàn),且可能引起GT1-7細(xì)胞Ca~(2+)超載,ATP合成障礙,細(xì)胞增殖受抑。特異性阻斷GPR54受體后,50-200 pg/ml AVP促進GnRH合成的作用顯著受抑(P0.05),而高濃度(1000 pg/ml以上)AVP的細(xì)胞毒性作用無明顯改變。此外,PLA和免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)AVP與GPR54之間可能存在相互作用。iTRAQ分析200 pg/ml AVP給藥6小時前后GT1-7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)AVP處理組和空白組差異表達(dá)蛋白相關(guān)性較高的通路主要有半胱氨酸-蛋氨酸代謝通路,脂肪酸代謝通路,丙酮酸代謝通路,脂肪酸合成通路,Ⅰ型糖尿病相關(guān)通路,嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)論:1)50mg/kg-100mg/kg巴戟天粗多糖能夠有效修復(fù)實驗性精索靜脈曲張進展期大鼠生殖功能,提高精子質(zhì)量,修復(fù)睪丸損傷,修復(fù)下丘腦神經(jīng)元突觸可塑性,上調(diào)Kiss1-GPR54系統(tǒng),促進GnRH合成與分泌。2)AVP可能直接作用于GT1-7細(xì)胞,增強GnRH啟動子活性,促進GnRH合成和釋放,該作用可能通過與GPR54受體直接或間接的相互作用實現(xiàn);此外,AVP可能通過上調(diào)GnRH神經(jīng)元GPR54受體水平,增強Kiss1-GPR54系統(tǒng)的作用,進而刺激GnRH的合成和分泌。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1 猜想 1：巴戟天粗多糖對實驗性精索靜脈曲張大鼠生殖軸的作用。Fig. 1 The first hypothesis: the effects of Morinda officinalis polysaccharides (MOon hypothalamus-pituitary-testicular axis of left experimental varicocele (ELVrats.

圖 2 猜想 2：血管加壓素與 GnRH 神經(jīng)元合成分泌活性的關(guān)聯(lián)。Fig. 2 The second hypothesis: correlation between vasopressin (AVP) and synthesiof GnRH.

圖 1.1 巴戟天粗多糖修復(fù)實驗性精索靜脈曲張雄鼠生殖軸損傷實驗流程圖。Fig 1.1 The flow chart of experiments that MOP attenuate male reproductive axis oELV rats.

【參考文獻】

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本文編號：2785889