【摘要】：作為天然藥物資源的重要組成部分,食藥用真菌發(fā)揮著重要的作用。現(xiàn)已從食藥用真菌的子實(shí)體內(nèi)分離出多種具有生理活性的物質(zhì),如:多糖、多肽、蛋白質(zhì)、萜類、固醇類、凝集素等,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖、降血壓以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。黃傘菌作為一種藥食性真菌,是目前最具開發(fā)潛力的食藥用真菌,具有豐富的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。隨著研究的深入,已有部分研究發(fā)現(xiàn)黃傘菌次級(jí)代謝產(chǎn)物能夠提高機(jī)體的免疫系統(tǒng),以及對(duì)某些腫瘤細(xì)胞能夠起到一定的抑制作用,為黃傘菌的進(jìn)一步研究提供了有利的證據(jù)。本文旨在提取黃傘菌次級(jí)代謝物中的抗腫瘤活性物質(zhì),對(duì)其進(jìn)行分離鑒定,為天然代謝產(chǎn)物的研究與開發(fā)提供新的思路。通過乙酸乙酯萃取的方法提取液氮研磨的新鮮黃傘菌子實(shí)體粉末中的次級(jí)代謝物,經(jīng)過反復(fù)的過濾、旋蒸、甲醇溶解、干燥等一系列方法,最終得到浸膏狀的黃傘菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測(cè)定抗腫瘤活性,采用體外抗腫瘤活性跟蹤與化學(xué)分離相結(jié)合的方法來分離黃傘菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。利用高效液相色譜(HPLC)分離次級(jí)代謝產(chǎn)物中的抗腫瘤活性成分,根據(jù)理化性質(zhì)和圖譜數(shù)據(jù)鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu),主要利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)和核磁共振(NMR)對(duì)收集得到的抗腫瘤活性成分進(jìn)行鑒定。具體研究結(jié)果如下:1.乙酸乙酯搖床提取最終得到黃傘菌次級(jí)代謝物浸膏。液氮研磨的新鮮黃傘菌子實(shí)體粉末加入1.5~2倍的乙酸乙酯搖床提取72 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干共得到黃傘菌次級(jí)代謝產(chǎn)物浸膏凈重為7.59 g。2.C18半制備色譜柱和C18分析色譜柱分離黃傘菌次級(jí)代謝物分別得到5個(gè)峰譜和3個(gè)活性峰譜。高效液相色譜分離甲醇充分溶解后的黃傘菌次級(jí)代謝物浸膏,首先C18半制備色譜柱按照甲醇:超純水=20%:80%的比例分離得到5個(gè)峰譜,所處的時(shí)間段分別為2~4 min、4~4.5 min、4.5~7 min、7~10 min以及10~14 min;其次C18分析色譜柱根據(jù)MTT法的結(jié)果對(duì)半制備色譜柱中的2個(gè)活性較高的峰譜再次分離,共得到3個(gè)活性峰譜,第一個(gè)峰譜所處的時(shí)間段分別為6.8~9.8 min,第二個(gè)峰譜為4.2~8 min,第三個(gè)峰譜為18~20.5 min。3.MTT比色法體外測(cè)定黃傘菌次級(jí)代謝物的抗腫瘤活性,最終確定HPLC兩次分離得到的所有峰譜中共有5個(gè)具有較高的抗腫瘤活性。MTT被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成結(jié)晶狀的深紫色的產(chǎn)物formazan,該產(chǎn)物能夠被特定溶劑完全溶解,然后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在570 nm波長(zhǎng)附近的吸光度(OD值)。HPLC兩次分離得到的峰進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),檢測(cè)到其中5個(gè)具有較高的抗腫瘤活性。4.HPLC分離得到的純品進(jìn)行鑒定,得到3號(hào)峰中活性物質(zhì)可能的相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)和核磁共振(NMR)對(duì)HPLC分離得到的具有抗腫瘤活性的純品進(jìn)行鑒定,得出其分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)等特征,經(jīng)過上述方法初步確定3號(hào)峰中的活性物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)式。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284.2
【圖文】：

黃傘Figure2-1Pholiotaadiposa

圖 2-2 黃傘次級(jí)代謝產(chǎn)物Figure 2-2 The secondary metabolite of P. adipos分離黃傘菌子實(shí)體粉末經(jīng)乙酸乙酯萃取，甲醇

圖 2-3 20%甲醇流動(dòng)相 HPLC 分離圖譜Figure 2-3 20% methanol flow phase HPLC separation map（2）圖 2-4 為 5%甲醇流動(dòng)相 HPLC 分離圖譜，該圖譜分離的是圖 2-3 中大量收集干燥后的第 3 個(gè)峰(4.5-7 min)，流動(dòng)相比例為甲醇:超純水=5%:95%（為了保證峰型更加清晰，超純水中加入了 0.1%/L 的三氟乙酸）。每針進(jìn)樣體積為 50 μ

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本文編號(hào)：2785822