【摘要】：研究背景及目的:淋巴瘤是一類原發(fā)于淋巴結(jié)和(或)結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤,病理可見(jiàn)分化、成熟程度不一的腫瘤性淋巴細(xì)胞大量增生,侵犯全身各個(gè)部位或組織。臨床以無(wú)痛性,進(jìn)行性淋巴結(jié)腫大為主要表現(xiàn)。常伴有發(fā)熱、盜汗、消瘦、肝脾大,晚期有貧血、惡病質(zhì)等臨床表現(xiàn)。近年研究發(fā)現(xiàn),淋巴瘤發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì),在全部腫瘤患者中所占的比例大約是5%,其中非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma,NHL)占惡性淋巴瘤的89.1%,約為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma,HD)的7倍。非霍奇金淋巴瘤高發(fā)病區(qū)為西歐、美國(guó)及中東,而中國(guó)、日本等為低發(fā)病區(qū)。在我國(guó),每10.0萬(wàn)人中有286人患癌,惡性淋巴瘤的發(fā)病率也不斷增加,逐漸成為威脅國(guó)民健康的一類主要的腫瘤。而在歐洲、美洲和大洋洲,惡性淋巴瘤的發(fā)病率可高達(dá)18/10萬(wàn),略高于各類白血病的總和。在美國(guó),惡性淋巴瘤每年新增患者3.0萬(wàn)以上。我國(guó)惡性淋巴瘤的死亡率為1.5/10.0萬(wàn),占所有惡性腫瘤死亡位數(shù)的第10-14位,與白血病比較相仿。從發(fā)病趨勢(shì)來(lái)看,霍奇金淋巴瘤趨于穩(wěn)定,而非霍奇金淋巴瘤在發(fā)達(dá)國(guó)家有上升趨勢(shì)。本病可發(fā)生于任何年齡,但發(fā)病年齡高峰在31-40歲,其中NHL高峰略往前移。男女之比為:2-3:1。一般認(rèn)為,可能和基因突變,以及病毒及其他病原體感染、放射線、化學(xué)藥物,合并自身免疫病等有關(guān)。惡性淋巴瘤是具有相當(dāng)異質(zhì)性的一大類腫瘤,雖然好發(fā)于淋巴結(jié),但是由于淋巴系統(tǒng)的分布特點(diǎn),使得淋巴瘤屬于全身性疾病,幾乎可以侵犯到全身任何組織和器官。因此,惡性淋巴瘤的臨床表現(xiàn)既具有一定的共同特點(diǎn),同時(shí)按照不同的病理類型、受侵部位和范圍又存在著很大的差異。T細(xì)胞淋巴瘤常以結(jié)外病變居多并且在活檢組織中常見(jiàn)壞死、凋亡,T細(xì)胞淋巴瘤的療效和預(yù)后較B細(xì)胞淋巴瘤差,因此對(duì)于T細(xì)胞淋巴瘤的分子學(xué)機(jī)制的進(jìn)一步研究及對(duì)其預(yù)后的更精確的評(píng)估顯得尤為重要。間變性大細(xì)胞淋巴瘤(Anaplastic Large Cell Lymphoma,ALCL)是 2008 年WHO分類確立的獨(dú)立類型。它是一種相對(duì)少見(jiàn)的、侵襲性較強(qiáng)的成熟的T細(xì)胞淋巴瘤,分為ALK陽(yáng)性和ALK陰性。ALK陽(yáng)性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤占成人非霍奇金淋巴瘤的3%,占兒童非霍奇金淋巴瘤的10%-20%,發(fā)病年齡多在35歲之前,男性多見(jiàn)。本病的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳學(xué)的異常有關(guān)。ALK介導(dǎo)的腫瘤基因t(2;5)即2p23上ALK基因易位至5q35的NPM(核磷酸蛋白),形成NPM-ALK融合基因,激活酪氨酸激酶配體而高表達(dá)NPM-ALK嵌合蛋白。這可能是ALCL成瘤的關(guān)鍵機(jī)制。包括Bcl-2增加、過(guò)甲基化作用、c-myc表達(dá)等。由于該病有較高的EBV抗原和EBV-DNA/RNA的表達(dá),有學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病與EB病毒感染有關(guān),但尚有爭(zhēng)議。根據(jù)美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南,間變性大細(xì)胞淋巴瘤的治療以化療為主,輔助以放療、手術(shù)、干細(xì)胞移植等聯(lián)合治療。疾病早期主張先化療后行病灶部位局部放療,中晚期則以化療為主。ALK陽(yáng)性的患者就診時(shí)大多已經(jīng)是晚期,常伴有外周或腹部淋巴結(jié)腫大,也可見(jiàn)結(jié)外累及,包括皮膚、骨、軟組織、肺、肝臟、骨髓,但腸道及中樞神經(jīng)受累較少見(jiàn)。通常伴隨B癥狀,特別是高熱,霍奇金淋巴瘤樣的ALCL也屬于ALK陽(yáng)性的ALCL,多發(fā)生于年輕人,發(fā)生縱膈累及的概率比較高,發(fā)病時(shí)多處于Ⅱ期,皮膚和骨骼累及少見(jiàn)。大部分病人ALK蛋白陽(yáng)性、PAX-5陰性。目前治療上采取以化療為主,據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)ALK陽(yáng)性的ALCL5年生存率約40%,復(fù)發(fā)率約30%,對(duì)局部復(fù)發(fā)的患者可以考慮在化療的基礎(chǔ)上加上局部放療,對(duì)復(fù)發(fā)難治的患者,對(duì)選擇與原來(lái)治療方案無(wú)交叉耐藥的二線方案。因此目前尋求高效低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)今ALCL治療的主要研究?jī)?nèi)容之一。中藥治療腫瘤在我國(guó)己有悠久歷史。通過(guò)臨床應(yīng)用證明,中草藥治療惡性腫瘤不但對(duì)化療和放療有著減毒、增效、增敏的效應(yīng);而且還具有預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用,阻斷癌前病變及抗腫瘤的作用。中草藥在治療腫瘤的同時(shí),還可以提高機(jī)體的免疫力,對(duì)人體自身正常的細(xì)胞不會(huì)有破壞作用,這是許多化療藥物所不具備的效果;同時(shí)中草藥還沒(méi)有明顯毒副反應(yīng)、藥源分布廣泛、價(jià)廉、適宜長(zhǎng)期應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn),是惡性腫瘤綜合治療中常用的有效手段之一。夏枯草具有清肝、明目、散結(jié)、消腫、止痛之功效。用于目赤腫痛、目珠夜痛、羞明流淚、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛。目前臨床上多用于治療甲狀腺腫大、淋巴結(jié)核、乳腺增生、高血壓、肺結(jié)核、急性黃疸型傳染性肝炎及細(xì)菌性痢疾等疾病。夏枯草含有豐富的化學(xué)成分,主要成分有:三萜類、甾體類、黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類、糖類、揮發(fā)油類、其他等。有關(guān)夏枯草抗腫瘤作用有較多的報(bào)道,例如應(yīng)用夏枯草治療甲狀腺癌、淋巴肉瘤、腮腺癌、扁桃腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等由來(lái)已久。綜上所述,夏枯草抗腫瘤活性的研究和作用機(jī)制的探討有著極大的科研價(jià)值及應(yīng)用前景。但是,目前,關(guān)于夏枯草抗腫瘤活性的研究仍然集中在粗提物,提取有效的抗腫瘤單體基本上是一片空白,并且,經(jīng)文獻(xiàn)檢索國(guó)內(nèi)外有關(guān)夏枯草體內(nèi)抗淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的實(shí)驗(yàn)報(bào)道很少。人類研究腫瘤目前已經(jīng)達(dá)到基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、表觀遺傳學(xué)的水平,基因組計(jì)劃全基因組測(cè)序的完成,標(biāo)志著后基因組時(shí)代的到來(lái),人們對(duì)蛋白質(zhì)研究的興趣越來(lái)越濃,蛋白質(zhì)組學(xué)研究也因此而有了飛快的發(fā)展。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在腫瘤防治領(lǐng)域具有重要作用,其在腫瘤發(fā)病機(jī)理的闡明,腫瘤的早期診斷、腫瘤的臨床治療、腫瘤的預(yù)后以及抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)上均顯示出光輝的應(yīng)用前景。代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想,對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式,是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下,基因表達(dá)的可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多,已知的有DNA甲基化(DNAmethylation),基因組印記(genomic imprinting),母體效應(yīng)(maternal effects),基因沉默(gene silencing),核仁顯性,休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯(RNAediting)等。蛋白質(zhì)作為生命存在的物質(zhì)基礎(chǔ),是細(xì)胞代謝和調(diào)控途徑的主要執(zhí)行者,也是多種致病因子和大多數(shù)藥物作用的靶分子。由于任何疾病在病理變化及臨床治療前后,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會(huì)有相應(yīng)的改變,所以,從理論上說(shuō),通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)檢測(cè),可以檢測(cè)出疾病早期及臨床治療前后蛋白質(zhì)質(zhì)和量的變化,以作為疾病早期診斷、療效評(píng)估及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。經(jīng)過(guò)我們團(tuán)隊(duì)近11年的研究,在體外實(shí)驗(yàn)中,為了研究夏枯草提取物對(duì)淋巴瘤的作用,我們首先采用體外實(shí)驗(yàn)鑒定夏枯草提取物對(duì)不同淋巴瘤細(xì)胞系的作用效果,我們使用夏枯草提取物分別作用于T細(xì)胞淋巴瘤Karpas299、Jurkat、HUT78細(xì)胞系,觀察對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤的抗增殖效果,發(fā)現(xiàn)這三者中,karpas299療效最好,從而選擇了間變大細(xì)胞淋巴瘤Karpas299細(xì)胞系作為研究對(duì)象。進(jìn)一步研究夏枯草提取物對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等的影響,采用TMT相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定夏枯草提取物作用Karpas299淋巴瘤細(xì)胞株的差異蛋白分子,其中發(fā)現(xiàn)表達(dá)明顯的下調(diào)蛋白轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和cyclin-D3,上調(diào)蛋白TNFα,它們能夠誘導(dǎo)或抑制一組具有潛在腫瘤的相關(guān)基因,根據(jù)篩選的結(jié)果采用Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證差異蛋白及相關(guān)蛋白的功能及機(jī)制,采用代謝組學(xué)技術(shù)鑒定夏枯草提取物作用Karpas299淋巴瘤細(xì)胞株的差異代謝產(chǎn)物,篩選尋找夏枯草提取物作用Karpas299淋巴瘤細(xì)胞株的可能作用機(jī)制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證夏枯草提取物的療效,我們使用BALB/c裸鼠成功構(gòu)建了 Karpas299淋巴瘤動(dòng)物模型,并觀察夏枯草提取物在體內(nèi)的作用效果,根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果,采用Western Blot研究關(guān)鍵蛋白及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,進(jìn)一步探索和驗(yàn)證夏枯草提取物的作用機(jī)制。第一部分夏枯草提取物對(duì)Karpas299細(xì)胞生物學(xué)特性的影響方法(1)分別培養(yǎng)Karpas299、Jurkat、HUT78三種T淋巴瘤細(xì)胞株。(2)采用CCK8的方法研究夏枯草提取物和長(zhǎng)春新堿對(duì)Karpas299、Jurkat、HUT78細(xì)胞增殖的影響,設(shè)置等比濃度梯度。(3)根據(jù)CCK8結(jié)果,選擇Karpas299進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)。(4)采用EDU檢測(cè)細(xì)胞周期,分析夏枯草提取物組、長(zhǎng)春新堿組、夏枯草提取物聯(lián)合長(zhǎng)春新堿組對(duì)Karpas299的作用差異。(5)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,分析夏枯草提取物組、長(zhǎng)春新堿組、夏枯草提取物聯(lián)合長(zhǎng)春新堿組的作用差異。結(jié)果(1)夏枯草提取物分別稀釋為 100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml的等比濃度,不同濃度的夏枯草提取物分別作用于karpas299、Jurkat、HUT78細(xì)胞24、48、72h后,觀察對(duì)karpas、Jurkat、HUT78細(xì)胞均有顯著的抑制增殖作用,發(fā)現(xiàn)在48h時(shí)抗腫瘤細(xì)胞增殖作用最強(qiáng),而且在48h時(shí),對(duì)karpas299細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為 79.41±2.56%、61.47.±1.90%、44.52±1.73%、30.38±1.04%、8.23±0.98%。其增殖 IC50 為(33.2±1.8)ug/ml;對(duì) Jurkat 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為 81.2±2.73%、62.35±1.89%、44.38±1.61%、29.56±1.04%、7.45±0.96%。其增殖IC50為(46.3±2.1)ug/ml;對(duì)HUT78細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為78.20±2.49%、60.35± 1.95%、45.38± 1.81%、32.56± 1.04%、9.01 ±0.97%。其增殖 IC50 為(47.1±2.2)ug/ml。且隨著夏枯草提取物濃度的增加,其抑制率越來(lái)越高,在一定濃度范圍內(nèi)存在劑量依賴性。長(zhǎng)春新堿對(duì)karpas299細(xì)胞也有明顯的抑制作用,藥物濃度分別為 0.008ug/ml、0.004ug/ml、0.002ug/ml、0.001ug/ml、0.0005ug/ml時(shí),不同濃度的長(zhǎng)春新堿分別作用于karpas299、Jurkat、HUT78細(xì)胞48h后,對(duì) Karpas299 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為 86.3±3.59%、67.92±2.66%、54.16±1.72%、27.56±1.38%、9.60±0.83%,其增殖 IC50 為(0.003±0.0004)ug/ml;對(duì) Jurkat 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為 89.26±2.65、50.19士2.42、41.05±1.87、30.68±1.35、19.73±1.11。其增殖 IC50 為(0.006±0.0009)ug/ml;對(duì) HUT78 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為 88.47±2.73、50.37±2.35、33.84±1.62、25.66±1.48、18.79±1.59。其增殖IC50為(0.007±0.0008)ug/ml。兩種藥物對(duì)細(xì)胞的抑制均有明顯的劑量依賴性。(2)從中選擇間變性大細(xì)胞淋巴瘤Karpas299細(xì)胞株作為研究對(duì)象,夏枯草提取物及長(zhǎng)春新堿注射液處理karpas299細(xì)胞的IC50分別為33.2μg/ml、0.003 ug/ml。兩種藥物各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組OD值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均0.001。(3)夏枯草提取物及長(zhǎng)春新堿注射液處理karpas299細(xì)胞48h,濃度采用IC50分別為33.2μg/ml、0.003ug/ml。結(jié)果顯示,空白組G0/G1期細(xì)胞占67.1±4.2%,G2/M期細(xì)胞占6.2±0.9%,夏枯草提取物組G0/G1期細(xì)胞占61.3±3.9%,G2/M期細(xì)胞占7.6±1.1%,長(zhǎng)春新堿組G0/G1期細(xì)胞占43.6±2.0%,G2/M期細(xì)胞占26.1±2.5%,聯(lián)合組G0/G1細(xì)胞占51.8±1.4%,G2/M期細(xì)胞占10.3±1.4%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示,與空白組相比,長(zhǎng)春新堿組G2/M期細(xì)胞明顯增多,p0.01(P=0.0016),聯(lián)合組G2/M期細(xì)胞有所增多,p0.05(P=0.038),夏枯草提取物組無(wú)明顯差異,p0.05。(4)夏枯草提取物及長(zhǎng)春新堿注射液處理karpas299細(xì)胞48h,濃度采用IC50分別為33.2μg/ml、0.003ug/ml。結(jié)果顯示,空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率(1.32±0.14)%,夏枯草提取物組的細(xì)胞凋亡率為(38.9±2.95)%,長(zhǎng)春新堿組的karpas299細(xì)胞凋亡率為(42.8±3.71)%,聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率為(66.3±7.52)%。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示各給藥組均可誘導(dǎo)Karpas299細(xì)胞的凋亡,P0.01(P=0.0093,P=0.0064,P=0.0058).小結(jié)(1)夏枯草提取物對(duì)Karpas299、Jurkat、HUT78細(xì)胞有顯著的抗增殖作用,其抗增殖作用呈明顯的時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。(2)夏枯草提取物對(duì)Karpas299的抗增殖作用無(wú)明顯細(xì)胞周期特異性。(3)夏枯草提取物可誘導(dǎo)Karpas299細(xì)胞的早期凋亡。第二部分夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞后的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及關(guān)鍵蛋白的功能驗(yàn)證方法(1)將Karpas299細(xì)胞分3組,分別為空白組、夏枯草提取物作用組(33.2μg/ml)、長(zhǎng)春新堿組(0.003ug/ml),每組3個(gè)重復(fù),夏枯草提取物、長(zhǎng)春新堿作用于Karpas299細(xì)胞48h后,分別收集各組細(xì)胞,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用細(xì)胞收集液洗滌3次,每管收集細(xì)胞個(gè)數(shù)5.0×107個(gè),液氮冷凍保存。利用1mMPMSF,2mMEDTA及DTT進(jìn)行蛋白提取。(2)采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。(3)差異蛋白分子進(jìn)行生物信息學(xué)分析,主要包括GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析。(4)通過(guò)查閱文獻(xiàn),尋找與腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵差異蛋白,然后對(duì)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行Western blot功能驗(yàn)證。結(jié)果(1)本項(xiàng)目采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開(kāi)展課題研究,在人細(xì)胞中共鑒定到蛋白質(zhì)6209個(gè)。按照表達(dá)倍數(shù)變化1.2倍以上(上調(diào)大于1.2倍或者下調(diào)小于0.83倍)且P value0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。其中,本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn),經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定表達(dá)上調(diào)219個(gè)蛋白質(zhì),表達(dá)下調(diào)321個(gè)蛋白質(zhì),與對(duì)照組相比,長(zhǎng)春新堿組的上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)有55個(gè),下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)77個(gè)。夏枯草提取物組的上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)有164個(gè),上調(diào)蛋白分別為Protein lifeguard3、AnnexinA1、CD 160 antigen、Perforin 1、Myomegalin、Prothrombin、Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 3B、Extracellular matrix protein 1、Filamin-B、Interferon-induced 35 kDa protein、Smoothelin、Thymidine phosphorylase、Vesicular integral-membrane protein VIP36、CathepsinD、TNF α、Nicotinamide phosphoribosyl transferase等,下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)244個(gè),下調(diào)蛋白分別為 Collagen type Ⅰ alpha 1、Synaptophysin、UV excision repair protein RAD23 homolog B、Myelin proteolipid protein、Synapsin-1、Antileukoproteinase、E3 ubiquitin-protein ligase RNF123、Stathmin、G02-q chimeric G-protein、Transcription factor c-Jun、Creatine kinase B-type、Putative heat shock protein HSP 90-beta 4、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit alpha、Protein FAM210A、MSTP067、cDNA FLJ78114、High mobility group protein B2、Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A、CyclinD3 等。經(jīng)過(guò)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化及重組蛋白的富集,SDS-PAGE,從中挑選TNFα、c-Jun和cyclinD3作為明顯差異蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證。(2)Western blot結(jié)果顯示給藥48h后,夏枯草提取物組、長(zhǎng)春新堿組、聯(lián)合組均不同程度下調(diào) p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、cyclinD3、Bcl-2、mTOR,上調(diào)TNFα、Bax、caspase3蛋白表達(dá)。與空白對(duì)照組相比,夏枯草提取物組高表達(dá) TNFα,P0.05(P=0.0217),低表達(dá) p-cJun,P0.05(P=0.0164),低表達(dá)cyclinD3,P0.05(P=0.0329);長(zhǎng)春新堿組高表達(dá)TNFα蛋白,P0.05(P=0.0283),低表達(dá) p-cJun,P0.05(P=0.0175),低表達(dá) cyclinD3,P0.05(P=0.0272);聯(lián)合組高表達(dá) TNFα 蛋白,P0.01(P=0.0079),低表達(dá) p-cJun,P0.01(P=0.0052),低表達(dá) cyclinD3,P0.01(P=0.0061)。小結(jié)(1)本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn),當(dāng)夏枯草提取物對(duì)karpas299細(xì)胞作用48h后,經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的諸多蛋白質(zhì),經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這些蛋白多與免疫相關(guān),提示夏枯草提取物抗腫瘤的作用機(jī)制可能與此有關(guān)。(2)經(jīng)過(guò)Western blot驗(yàn)證,夏枯草提取物下調(diào)了 p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、Bcl-2、cyclinD3、mTOR,上調(diào)了 TNFα、Bax、caspase3 蛋白表達(dá),提示可能通過(guò)JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用。第三部分夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞后的代謝組學(xué)分析方法(1)將Karpas299細(xì)胞分3組,分別為空白組、夏枯草提取物作用組(33.2μg/ml)、長(zhǎng)春新堿組(0.003ug/ml),每組6個(gè)重復(fù),夏枯草提取物、長(zhǎng)春新堿作用于Karpas299細(xì)胞48h后,分別收集各組細(xì)胞,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用細(xì)胞收集液洗滌3次,每管收集細(xì)胞個(gè)數(shù)5.0×107個(gè),液氮冷凍保存。(2)采用超聲裂解法提取蛋白質(zhì)。(3)采用 Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)HILIC色譜柱進(jìn)行分離。分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。樣品UHPLC分離后用TripleTOF5600質(zhì)譜儀(ABSCIEX)進(jìn)行質(zhì)譜分析。(3)采用XCMS程序進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(25ppm)和二級(jí)譜圖匹配的方式。(4)根據(jù)目標(biāo)代謝物在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的C number分別提取目標(biāo)代謝物所參與的所有代謝通路,并通過(guò)KEGG Mapper軟件分別標(biāo)注代謝通路中的目標(biāo)代謝物。(5)對(duì)代謝物進(jìn)行聚類分析。在對(duì)目標(biāo)代謝物集合KEGG通路注釋的富集分析時(shí),以KEGG通路為單位,以每條通路中所有代謝物為背景,通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)。結(jié)果(1)將QC樣本UHPLC-Q-TOFMS總離子流圖,進(jìn)行譜圖重疊比較,結(jié)果表明各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊,說(shuō)明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器誤差引起的變異較小。(2)經(jīng)Pareto-scaling后進(jìn)行PCA分析,正、負(fù)離子模式下QC樣本緊密聚集在一起,表明本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好。(3)夏枯草提取物和空白組在正離子模式下差異代謝物有L-Carnitine、Betaine、L-Palmitoylcarnitine、Taurine、Glycerophosphocholine,負(fù)離子模式下差異代謝物有 Stearic acid、Glycerol 3-phosphate、Arachidonic Acid(peroxide free)、Linoleic acid、L-Palmitoylcarnitine、Stearoylcarnitine、Taurine、alpha-D-Galactose 1-phosphate、2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate。長(zhǎng)春新堿組和空白組在正離子模式下差異代謝物有 alpha-D-Glucose 1-phosphate、Uridine 5'-monophosphate(UMP)、Uridine 5'-diphosphate(UDP)、Pantothenate,負(fù)離子模式下差異代謝物有 Linoleic acid、L-Citrulline、Uridine 5'-monophosphate(UMP)、alpha-D-Galactose 1-phosphate、cDNA FLJ56762、Alpha-2-HS-glycoprotein、cDNA FLJ52778、Insulin-like growth factorbinding protein 7、Keratin,type Ⅱ cytoskeletal 2 epidermal。小結(jié)(1)夏枯草提取物在抑制Karpas299.細(xì)胞增殖的過(guò)程中,生成了多種代謝物,且有多條代謝通路參與,尤其是UDP-D-Galactose、alpha-D-Glucose 1-phosphate等具有明顯差異的代謝產(chǎn)物。(2)這些代謝產(chǎn)物多參與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡,研究這些代謝產(chǎn)物的功能和變化,及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)或抑制效應(yīng)。第四部分夏枯草提取物對(duì)Karpas299淋巴瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及關(guān)鍵蛋白的功能驗(yàn)證方法(1)使用BALB/c裸鼠構(gòu)建Karpas299淋巴瘤動(dòng)物模型,先把夏枯草提取物分為低劑量組、中劑量組、高劑量組,根據(jù)抑瘤率篩選出最佳劑量,然后分空白對(duì)照組、夏枯草提取物組(最佳劑量組)、長(zhǎng)春新堿組、聯(lián)合組(夏枯草最佳劑量組聯(lián)合長(zhǎng)春新堿組)。(2)每日觀察各組荷瘤小鼠的生長(zhǎng)情況,隔日稱重,記錄各組小鼠給藥期的體重變化。(3)測(cè)量瘤體大小,觀察瘤體的變化,最后計(jì)算抑瘤率。(4)瘤組織做病理HE染色、免疫組化。(5)根據(jù)細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果,從瘤組織中提取蛋白,通過(guò)Westernblot方法來(lái)檢測(cè) p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、TNFα、cyclinD3、Bcl-2、Bax、caspase3、mTOR等蛋白在瘤組織中的表達(dá)變化。結(jié)果(1)Karpas299淋巴瘤動(dòng)物模型成瘤率100%,結(jié)合病理免疫組化染色,證明模型制備成功。(2)夏枯草提取物能夠抑制Karpas299淋巴瘤生長(zhǎng)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比,夏枯草中劑量組的瘤重縮小明顯,P0.01(P=0.0044),夏枯草低劑量組和高劑量組的瘤重有所縮小,P0.05(P=0.0283,P=0.0196),各組的瘤體積均變化明顯,P0.01(P=0.0075,P=0.0062,P=0.0071)。各組抑瘤率分別為27.3%、40.1%、31.5%。因此我們選擇夏枯草中劑量組作為正式實(shí)驗(yàn)的劑量。在正式實(shí)驗(yàn)中,與空白對(duì)照組相比,夏枯草提取物組、長(zhǎng)春新堿組和聯(lián)合組瘤組織體積增大明顯減少,P0.01(P=0.0094,P=0.0091,P=0.0077),夏枯草提取物組、長(zhǎng)春新堿組和聯(lián)合組的平均瘤重明顯小于空白對(duì)照組,P0.01(P=0.0072,P=0.0055,P=0.0068)。各組抑瘤率分別為 38.9%、39.5%、39.1%。(3)免疫組化提示T細(xì)胞標(biāo)記CD3,CD5,CD7均呈現(xiàn)不同程度的表達(dá),CD30均為彌漫細(xì)胞膜陽(yáng)性。ALK在空白對(duì)照組和夏枯草提取物組為細(xì)胞漿陽(yáng)性,其余組均為陰性。ki-67在空白對(duì)照組,夏枯草提取物組和長(zhǎng)春新堿組增殖指數(shù)較高,為60-80%.在其他組增殖指數(shù)為30-40%。與空白對(duì)照組相比,各給藥組表達(dá)c-Jun均有所降低,P0.05(P=0.0291)。各給藥組之間比較無(wú)明顯差異,P0.05。各給藥組cyclinD3的表達(dá)均有所降低,P0.05(P=0.0406)。聯(lián)合組的cyclinD3明顯降低,P0.01(P=0.0054)。各給藥組均高表達(dá)TNFα,夏枯草提取物組TNFα表達(dá)有所增加,P0.05(P=0.0316),長(zhǎng)春新堿組和聯(lián)合組TNFα的表達(dá)明顯增加,P0.01(P=0.0082)。(4)通過(guò)Western blot檢測(cè)各組瘤組織的蛋白表達(dá),與空白對(duì)照組相比,夏枯草提取物組高表達(dá)TNFα,P0.01(P=0.0047),低表達(dá)p-cJun,P0.05(P=0.0265),低表達(dá) cyclinD3,P0.05(P=0.0329);長(zhǎng)春新堿組高表達(dá) TNFα蛋白,P0.01(P=0.0051),低表達(dá) p-cJun,P0.01(P=0.0078),低表達(dá) cyclinD3 P0.01(P=0.0096);聯(lián)合組高表達(dá) TNFα 蛋白,P0.01(P=0.0015),低表達(dá) p-cJun,P0.01(P=0.0012),低表達(dá) cyclinD3,P0.01(P=0.0053)。小結(jié)(1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明夏枯草提取物能夠抑制Karpas299淋巴瘤,且夏枯草中劑量組療效優(yōu)于高劑量組和低劑量組。(2)通過(guò)免疫組化和Western blot驗(yàn)證,夏枯草提取物下調(diào)了 p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、Bcl-2、cyclinD3、mTOR,上調(diào)了 TNFα、Bax、caspase3蛋白。夏枯草提取物可能是通過(guò)JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。全文結(jié)論1.夏枯草提取物對(duì)Karpas299細(xì)胞有顯著的抗增殖、促凋亡作用,無(wú)明顯細(xì)胞周期特異性。2.夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞后,經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定表達(dá)上調(diào)219個(gè)蛋白質(zhì),表達(dá)下調(diào)321個(gè)蛋白質(zhì),這些蛋白可能揭示夏枯草提取物抗腫瘤的作用,經(jīng)Western blot驗(yàn)證,夏枯草提取物可能通過(guò)JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。3.夏枯草提取物作用Karpas299細(xì)胞后,經(jīng)代謝組學(xué)分析,正離子模式有9種差異代謝物,負(fù)離子模式有14種差異代謝物,這些代謝物大多在腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,可能是夏枯草提取物抑制Karpas299細(xì)胞的作用機(jī)制。4.夏枯草提取物能夠抑制Karpas299淋巴瘤生長(zhǎng),可能通過(guò)JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

具有明顯的周期特異性，夏枯草提取物組未顯示明顯的細(xì)胞周期特異性，聯(lián)合逡逑組也將細(xì)胞周期阻滯于ｍ期，具有細(xì)胞周期特異性，但由于細(xì)胞大量凋ｒ：，較逡逑長(zhǎng)春新堿組有所下降。（見(jiàn)圖１．３）逡逑１３逡逑

各組karpas299G2/M期細(xì)胞的檢測(cè)

枯草提取物對(duì)Ｋａｒｐａｓ邋２９９細(xì)胞增殖的影響逡逑研[偨峁允鞠目薟萏崛∥鋃裕耄幔潁穡幔簀澹玻梗瓜赴邢災(zāi)腦魷目薟萏崛∥錙ǘ鵲牟煌�，其曳N坡仕孀排ǘ鵲腦黽雍褪弊哦矣忻饗緣募亮亢褪奔湟覽敵�。同一种药武Z圓煌牡�，提示药武Z圓煌鬧琢魷赴乖鮒匙饔檬遣煌�。细胞生命特睁崿细胞以分劣�(xùn)姆絞澆性鮒場(chǎng)Ｖ琢魷赴納�，不受正常生长调控系蛙嚹控制，钠H中姆至延朐鮒常郟福梗蕁Ｒ部怪琢齙鬧匾饔彌�。夏克W荻災(zāi)琢魷赴囊種圃鮒場(chǎng)３魯びⅲ郟梗眩莘⑾窒目薟萏崛∥錟芄灰種疲遙幔輳橄赴鮒常確段�，随着夏克W萏崛∥錙ǘ鵲腦黽櫻潿裕遙幔輳橄赴镎癲郟梗保薟捎茫停裕苑ü鄄煜目薟萏崛∥鎰饔茫剩酰潁耄幔糲赴筇崛∥錕上災(zāi)種疲剩酰潁耄幔糲赴納ぃ⒂幸歡ǖ牧啃Ч叵擔(dān)

本文編號(hào)：2782430