【摘要】：目的:探究中藥金銀花石油醚部位抗特發(fā)性肺纖維化疾病的藥效活性及作用機(jī)制,并對(duì)其可能藥效化學(xué)成分進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。通過(guò)建立體外細(xì)胞模型對(duì)金銀花石油醚部位進(jìn)行藥效探究和機(jī)制分析,在此基礎(chǔ)上利用體內(nèi)動(dòng)物模型對(duì)體外篩選結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)一步確定藥效。同時(shí)利用GC-MS和LC-MS技術(shù)分析金銀花石油醚部位化學(xué)成分,對(duì)其可能藥效成分進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。方法:1、體外實(shí)驗(yàn):基于本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)驗(yàn)證并使用的體外TGF-β1誘導(dǎo)的A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型為基礎(chǔ),采用RT-PCR法檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ(Col I)以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Eepithelial-to-mesenchymal transition,EMT)過(guò)程相關(guān)基因:E-鈣黏蛋白(E-cadherin)基因、波形蛋白(Vimentin)基因、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的基因表達(dá)情況;采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中羥脯氨酸(HYP)含量變化,對(duì)金銀花石油醚部位治療特發(fā)性肺纖維化體外藥效及作用機(jī)制進(jìn)行初步探究。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):以博萊霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠IPF模型為基礎(chǔ),通過(guò)對(duì)小鼠肺組織石蠟切片,進(jìn)行HE、Masson染色觀察肺部病理狀況;ELISA檢測(cè)小鼠肺組織中HYP的表達(dá)情況;采用RT-PCR法檢測(cè)肺組織勻漿中膠原蛋白Ⅰ(Col I)以及EMT過(guò)程中的標(biāo)志基因E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表達(dá)情況。進(jìn)而對(duì)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。3、金銀花石油醚部位成分進(jìn)行GC-MS和LC-MS定性分析,對(duì)其可能藥效成分進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。結(jié)果:1、體外實(shí)驗(yàn):形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示金銀花石油醚部位可有效抑制TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,使纖維樣細(xì)胞向正常上皮細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變;RT-PCR結(jié)果表明金銀花石油醚加藥組相比于TGF-β1誘導(dǎo)的模型組E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào),Col I、α-SMA、Vimentin mRNA表達(dá)下調(diào);ELISA結(jié)果顯示加藥組相對(duì)模型組羥脯氨酸含量降低。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):HE和Masson染色結(jié)果顯示假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,無(wú)出血點(diǎn),膠原沉積量少,模型組肺壁明顯增厚,肺間隔明顯變小,實(shí)質(zhì)性病變呈現(xiàn)片狀,膠原沉積明顯,金銀花石油醚部位組肺泡壁略微增厚,肺泡間隔明晰,實(shí)質(zhì)性病變減少,未見明顯膠原沉積,與模型組相比有所好轉(zhuǎn)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示金銀花石油醚部位加藥組的肺組織勻漿中羥脯氨酸的含量明顯低于模型組,RT-PCR結(jié)果表明肺組織勻漿中E-cadherin mRNA表達(dá)上調(diào),Col I、α-SMA、Vimentin mRNA基因表達(dá)下調(diào)。3、采用GC-MS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)金銀花藥效部位進(jìn)行定性分析共鑒定出22種化合物,主要為脂肪酸類、脂類、甾醇類和醛類。4、采用UPLC-Q-Extractive/MS技術(shù)對(duì)金銀花藥效部位進(jìn)行定性分析,總共鑒定以新綠原酸、綠原酸、咖啡酸等酚酸類成分為主的14種化學(xué)成分。結(jié)論:金銀花石油醚部位可有效抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)重要組成蛋白Col I的基因表達(dá),減少該膠原蛋白主要氨基酸成分羥脯氨酸分泌,證明在體外實(shí)驗(yàn)中,金銀花石油醚部位具有抗特發(fā)性肺纖維化的藥效活性。在此基礎(chǔ)上,采用RT-PCR技術(shù)從基因水平對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的標(biāo)志性蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin含量變化進(jìn)行探究,結(jié)果顯示金銀花石油醚部位對(duì)EMT過(guò)程有抑制作用,證明金銀花抗特發(fā)性肺纖維化的體外活性作用機(jī)制可能與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。在此基礎(chǔ)上,采用博萊霉素誘導(dǎo)的體內(nèi)肺纖維化動(dòng)物模型對(duì)其治療藥效進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。從HE、MASSON以及ELISA結(jié)果均可看出,金銀花石油醚部位對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠有潛在治療作用。此外,RT-PCR結(jié)果也顯示該部位作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。GC-MS和LC-MS分析發(fā)現(xiàn),金銀花石油醚部位主要成分為脂肪酸類、脂類、甾醇類、醛類,以及酚酸類成分,從而提示此類成分及其組合有可能是抗特發(fā)性肺纖維化的潛在活性物質(zhì)。綜上所述,金銀花石油醚部位抗特發(fā)性肺纖維化的作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性基因(Vimentin、α-SMA、E-cadherin)實(shí)現(xiàn)的。本研究為抗肺纖維化新藥研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

金銀花石油醚部位對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用（X±s,n=3）

注：1.空白對(duì)照組；2.模型組；3.金銀花石油醚 2.5 μg·mL-1組；4.金銀花石油醚 5 μg·mL-1組；5.金銀花石油醚 10 μg·mL-1組。圖 2-1 不同劑量金銀花石油醚部位對(duì) TGF-β誘導(dǎo)的 A549 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響（200×）3.2 金銀花石油醚部位對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ColⅠ、E-cadherin、Vimentin、α-SMAmRNA的表達(dá)水平的影響采用 RT-PCR 法檢測(cè)不同濃度金銀花石油醚部位對(duì) A549 細(xì)胞中 ColⅠ、α-SMA、Vimentin 和 E-cadherin mRNA 基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，模型組 ColⅠ、α-SMA 和 VimentinmRNA 明顯升高（P＜0.05），E-cadherin mRNA 明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比較，加藥低劑量組 ColⅠmRNA（P＜0.01），α-SMA、Vimentin mRNA 降低，E-cadherin mRNA 升高；加藥中劑量組 ColⅠmRNA（P＜0.01），α-SMA、Vimentin mRNA 降低（P＜0.05），E-cadherin mRNA 升高（P＜0.01）；加藥高劑量組 ColⅠ、Vimentin mRNA（P＜0.01），α-SMAmRNA 降低（P＜0.05），

金銀花石油醚部位對(duì) A549 細(xì)胞內(nèi) E-cadherin、Vimentin 、α-SMA、ColⅠ mRNA 表達(dá)的影響( X ±s, n=3)E-cadherin (%) Vimentin(%) α-SMA (%) ColⅠ (%)對(duì)照組 100 100 100 100模型組 42.49±16.532）175.69±38.081）142.76±8.222）5695.27±691.262）低劑量組 54.23±9.33 152.00±4.4 132.09±2.5194）4837.39±350.193）中劑量組 195.00±8.794）122.89±12.294）112.61±4.954）3706.98±403.044）高劑量組 114.00±13.234）109.419±20.244）103.87±2.874）3100.07±457.644）注：與空白對(duì)照組比較1）P㩳0.05，2）P㩳0.01；與模型組比較3）P㩳0.05，4）P<0.01。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2782356