【摘要】：目的:凝血酶是抗凝血的重要靶點(diǎn),新型口服抗凝藥直接作用于凝血酶發(fā)揮抗凝作用。新型口服抗凝藥具有出血、缺乏特異對(duì)抗劑、漏服發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥等嚴(yán)重不良反應(yīng)。丹參作為活血化瘀最常用的中藥,目前研究表明其成分具有較強(qiáng)的抗凝血作用,當(dāng)歸常與丹參配伍的用作活血抗凝,因此選擇丹參和當(dāng)歸作為超濾親和篩選對(duì)象。本文擬建立超濾親和凝血酶抑制劑篩選方法,快速高通量篩選中藥中抗凝血酶成分。對(duì)丹參、當(dāng)歸的成分進(jìn)行凝血酶結(jié)合后的超濾篩選,并通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定和抗凝血活性測(cè)定確定抗凝血酶活性成分。而后通過(guò)活性驗(yàn)證及等溫滴定量熱技術(shù)對(duì)丹參和當(dāng)歸中抗凝血酶活性成分進(jìn)行機(jī)制研究,以期確認(rèn)其抗凝活性并探究其抗凝血酶機(jī)制。方法:1.建立基于超濾親和技術(shù)的抗凝血酶活性成分篩選方法,考察不同孵育時(shí)間及孵育溫度對(duì)方法的影響,并考察凝血酶的溶劑耐受性。2.通過(guò)UPLC法分離丹參、當(dāng)歸的醇提物和水提物,建立其指紋圖譜。3.通過(guò)UPLC-LTQ-Obitrap-MSn質(zhì)譜儀對(duì)丹參、當(dāng)歸成分進(jìn)行鑒定,而后通過(guò)建立的超濾親和篩選方法對(duì)丹參、當(dāng)歸進(jìn)行抗凝血酶活性成分篩選。4.通過(guò)生色底物法驗(yàn)證篩選成分的抗凝血酶活性并通過(guò)等溫滴定量熱儀(ITC)測(cè)定潛在抗凝血酶活性成分與凝血酶的滴定曲線,分析熱力學(xué)參數(shù),并探討潛在活性成分的作用機(jī)制。結(jié)果:1.本文成功建立超濾親和抗凝血酶活性成分篩選方法,經(jīng)考察,確定孵育條件為37℃下孵育40min。滅活凝血酶對(duì)丹酚酸A無(wú)結(jié)合,證明凝血酶雖然與配體不存在非特異性結(jié)合,特異性的結(jié)合占主要地位。凝血酶具有較好的溶劑耐受性,在30%DMSO PBS溶液和60%甲醇中能保持50min穩(wěn)定的活性。2.建立了丹參水提物和醇提物及當(dāng)歸水提物和醇提物的UPLC分離方法,結(jié)果顯示所有分離良好,樣品溶液各色譜峰面積及保留時(shí)間均無(wú)顯著性差異,重復(fù)性良好。3.本文在丹參水提物、丹參醇提物、當(dāng)歸水提物、當(dāng)歸醇提物中分別篩選9、9、4、7個(gè)潛在抗凝血酶活性成分。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品、reayxs數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)參考文獻(xiàn)比對(duì),指認(rèn)了丹參水提物中26個(gè)成分,丹參醇提物中22個(gè)成分,當(dāng)歸水提物中24個(gè)成分、當(dāng)歸醇提物中45個(gè)成分,為超濾親和篩選后的成分確定提供基礎(chǔ),同時(shí)為丹參、當(dāng)歸的物質(zhì)研究提供的新的基礎(chǔ)。4.經(jīng)活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),確定了丹參素、β熊果苷、丹酚酸D、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ具有抗凝血酶活性,α熊果苷不具有抗凝血酶活性,確證了方法的可靠性。等溫滴定量熱法測(cè)定丹酚酸D與凝血酶的結(jié)合為離子鍵結(jié)合,揭示了凝血酶與潛在活性成分可能的作用方式。結(jié)論:本研究為從復(fù)雜的天然藥物中尋找抗凝血酶活性成分提供了可靠的篩選方法;為其他酶的抑制劑篩選提供了新的思路;為非水溶性化合物的超濾親和篩選方法提供了新思路;為小分子藥物與酶等生物大分子的相互作用研究提供了有效方法;同時(shí)對(duì)于丹參、當(dāng)歸抗凝血酶活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考和依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284
【圖文】：

血栓性疾病越來(lái)越成為誘發(fā)心腦血管系統(tǒng)的主要因素，嚴(yán)重威脅著人類生逡逑命健康。導(dǎo)致血栓形成的主要三個(gè)因素為：血管因素；血液理化性質(zhì)的改變；血液流變逡逑學(xué)的改變［１］。其中，凝血和抗凝血過(guò)程如圖１．１所示：逡逑內(nèi)源性凝血途徑邐外源性凝血途徑逡逑Ｉ邐古逡逑Ｘ邐？Ｘａ邋？邐Ｘ逡逑纖溶酶原逡逑ｎ邋%煎危懼澹齲徨危赍澹煎蝸巳苊岡せ釵镥義希岡駑澹福╁蝸巳苊稿義峽鼓肛必�，ＯX危掊義希懾�？e徨邋危澹牛模繡義希ㄏ宋鞍自ㄏ宋鞍祝ㄏ宋鞍捉到獠錚╁義賢跡保毖耗獺⒖鼓胂宋鞍姿夤�，实线为凝血过倡H⑿橄呶鼓體義夏甘欽瞿討械淖詈笠患�，地位十贩N匾�。灾J褐杏耄危幔岷銑蝕倌義希ǎ媯幔螅簦┕剮�，单秮�(lái)嬖誄士鼓ǎ螅歟錚鰨┕剮�，通过碟X冢危幔吶ǘ齲詞迪摯鼓澳﹀義夏�。与Ｎａ＋结合的凝血酶，能够特覕棠结合纤维蛋熬Y停校粒沂芴�，促使纤维蛋白原转化辶x銜宋鞍�。同时，能够特异芯壞切割ＰＡ＿b俳“寰奐�；引迄g淥蜃擁惱義戲蠢�，使凝血酶｀P杉絳福揮盞薊罨勸濱０訪敢蜃櫻兀桑桑傻韌肥迪執(zhí)馘義轄耗痰墓δ埽�。辶x夏傅慕岷銜壞閿校夯钚越岷銜壞悖ǎ幔悖簦椋觶邋澹螅椋簦澹

本文編號(hào)：2782221