【摘要】：目前,代謝性疾病已成為世界范圍內(nèi)最常見的、對人們健康構(gòu)成主要威脅的一類非傳染性疾病。盡管代謝性疾病的許多確切機制尚不清晰,大量的研究表明過度激活的炎癥反應是重要的病因之一。巨噬細胞等免疫細胞的炎性浸潤構(gòu)成了炎性反應環(huán)境的主要特點。表型/功能的可塑性和異質(zhì)性是巨噬細胞的兩個主要特征一一巨噬細胞在應對相應細胞外環(huán)境刺激時可分別活化成促炎的經(jīng)典活化M1型巨噬細胞和抗炎的替代活化M2型巨噬細胞。巨噬細胞表型的差異調(diào)節(jié)對這些代謝性炎癥疾病的進展有著深遠的影響。雷公藤紅素(celastrol)是從原產(chǎn)于中國南方的多年生匍匐植物雷公藤的根皮中分離出的一種天然五環(huán)三萜類醌甲基化合物,已經(jīng)在幾種動物實驗模型中表現(xiàn)出了有效的抗炎作用,因此一般被用于治療慢性炎癥、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病。但雷公藤紅素是否能通過調(diào)節(jié)小鼠腹腔原代巨噬細胞的極化分型來發(fā)揮抗炎作用仍需我們進一步探索。Sirtl(Silent mating type information regulation 2 homolog 1)是調(diào)節(jié)代謝的進化上高度保守的NAD+依賴的蛋白去乙�；�,最近的研究已確定其在多個組織糖脂代謝中的關鍵地位。我們實驗室前期的研究表明,雷公藤紅素能通過促進Sirt1的過表達改善小鼠由于高脂飲食引起的炎癥等肝臟代謝損傷。血紅素加氧酶(Heme oxygenase,HO)是血紅素分解代謝的關鍵酶,它有三種類型的同工酶,HO-1(氧應激誘導型)、HO-2(組成型)和HO-3(尚未明確)。其中,HO-1已被證實在抗氧化防御、抗炎和抗凋亡方面具有重要作用。我們實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn),Sirt1的過表達誘導了 HO-1的表達,從而發(fā)揮了抗氧化的作用。那么雷公藤紅素能否通過Sirt1和HO-1調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化從而發(fā)揮抗炎作用改善代謝損傷呢?本課題就這一問題進行了以下實驗。我們首先利用實驗室留存的 WT(ND/HFD;con/cel)和 Sirtl-/(ND/HFD;con/cel)小鼠肝組織進行了預實驗一一將上述肝組織提RNA后,用qRT-PCR技術(shù)檢測了巨噬細胞極化分型相關基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能使WT小鼠肝組織M2型巨噬細胞相應標志物的mRNA水平極大提高,但Sirtl-/-小鼠肝組織M2型巨噬細胞相應標志物的mRNA表達均下降。這一結(jié)果說明雷公藤紅素對巨噬細胞的極化分型有影響,且其機制很可能與Sirtl基因有關。接著,我們以灌肉湯法(刺激法)分離的小鼠腹腔巨噬細胞為主要研究對象,分別用qRT-PCR技術(shù)和流式細胞術(shù)檢測了對照組(con)、單純雷公藤紅素干預組(cel)、經(jīng)典激活Ml組(IFN-y+LPS)和雷公藤紅素干預M1組(IFN-y+LPS+cel)四組細胞中M1型和M2型巨噬細胞相關標志物的表達——qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,雷公藤紅素引起M1型巨噬細胞相應標志物CD11c、iNOS表達減少,使M2型巨噬細胞相應標志物Arg-1表達增加;流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示,雷公藤紅素能使F4/80+CD11c+ M1型巨噬細胞和CD11c+CD206-M1型巨噬細胞的比例均下降。這些實驗結(jié)果說明,雷公藤紅素能抑制小鼠腹腔巨噬細胞向M1型極化。之后的實驗結(jié)果顯示,Sirt1抑制劑EX-527組的M2型巨噬細胞相關標志物mRNA表達減少,EX-527干預雷公藤紅素組的M1型巨噬細胞的比例增加。此外,Western blot實驗結(jié)果顯示,在刺激法分離的小鼠腹腔巨噬細胞和小鼠單核巨噬細胞株Raw264.7中,雷公藤紅素均能促進Sirt1蛋白和HO-1蛋白的表達。在我們用分化成熟的3T3-L1脂肪細胞和小鼠單核巨噬細胞株Raw264.7構(gòu)建的脂肪組織炎癥模型中,雷公藤紅素也能促進Sirt1和HO-1的蛋白表達,且給予EX-527后,Sirt1和HO-1的蛋白表達均下降。上述結(jié)果均表明,雷公藤紅素可能通過Sirt1和HO-1調(diào)節(jié)小鼠腹腔巨噬細胞的極化分型。這一結(jié)果對改善巨噬細胞炎性浸潤環(huán)境有一定的啟發(fā)和意義。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖３．各處理組Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ型巨噬細胞比例的比較逡逑Ｆｉｇ．３．邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｇｒｏｕｐｓ．邋Ｗｅ邋ｕｓｅ邋ＡＰＣ邋ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ邋Ｆ４／８０邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ａｎｄ邋ＰＥ邋ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ邋ＣＤｌｌｃ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｔｏ逡逑ｍａｒｋ邋Ｍｌ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ａｓ邋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１邋ｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．邋（Ａ）邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋／邋Ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋（Ｂ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１邋ｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ．邋（Ｃ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．邋Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ逡逑ｄｅｃｒｅａｓｅｓ邋ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃｆ邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．邋（Ｄ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＩＦＮ－ｙ＋ＬＰＳ邋ｇｒｏｕｐ．邋（Ｅ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋逡逑Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＩＦＮ－ｙ＋ＬＰＳ＋ｃｅｌ邋ｇｒｏｕｐ邋（ａｌｓｏ邋ｋｎｏｗｎ邋ａｓ邋ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ逡逑Ｍｌ邋ｇｒｏｕｐ）．邋Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋Ｍｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｄｅｃｒｅａｓｅｓ邋ｐｒｏｐｏ

圖４．各處理組ＣＤｌｌｃ＋ＣＤ２０６－?

圖５．邋Ｓｉｒｔｌ抑制劑ＥＸ－５２７對小鼠腹腔巨噬細胞極化分型的影響逡逑Ｆｉｇ．５．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＥＸ－５２７邋（Ｓｉｒｔｌ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）邋ｏｎ邋ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ逡逑ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｄｅｔｅｃｔ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｍＲＮＡ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｍ２邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ逡逑ｔｙｐｉｃａｌ邋ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ邋ｉｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ａｎｄ邋ＥＸ－５２７邋ｇｒｏｕｐ．邋Ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｄｅｔｅｃｔ逡逑Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＾邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｃｅｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｃｅｌ＋Ｅｘ－５２７邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｕｓ邋ｗｅ邋ｃａｎ逡逑ｃｏｍｐａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｂｏｔｈ邋ｇｒｏｕｐｓ．邋Ｂｏｔｈ逡逑ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ邋ａｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ邋ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＥＸ－５２７邋（Ｓｉｒｔｌ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）邋ｏｎ邋ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ逡逑ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．邋（Ａ）邋ＥＸ－５２７邋ｇｒｏｕｐ邋ｓｈｏｗｓ邋ａ邋ｔｒｅｎｄ邋ｏｆ邋ｄｅｃｒｅａｓｅｄ邋Ａｒｇ－１逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；邋ＥＸ－５２７邋ｄｅｃｒｅａｓｅｓ邋ＣＤ２０６邋ｎｉＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ；邋ＥＸ－５２７邋ｇｒｏｕｐ逡逑ｓｈｏｗｓ邋ａ邋ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ邋ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩＬ－１０邋ｍ

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本文編號：2782198