【摘要】：靈芝(Ganoderma lucidum)為我國傳統(tǒng)名貴中藥,富含三萜、多糖、氨基酸、生物堿等多種活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝護肝等生物活性。隨著人們對靈芝保健功能的認識,靈芝的消費群體已從中國、日本、馬來西亞等東南亞國家擴展至歐美西方國家,但野生靈芝資源非常稀少,人工栽培是獲得靈芝產(chǎn)品的主要方式。在靈芝子實體生長過程中需要高濕度環(huán)境,如果管理不善,會導致病原真菌的感染;而且靈芝采后如不能及時干燥亦會發(fā)生霉變,為實現(xiàn)靈芝病原真菌的防治,本研究首先對病變靈芝的主要病原真菌進行研究,分離獲得的四株病原真菌菌株,經(jīng)形態(tài)學和rDNA-ITS序列分析確定OTA為黃曲霉Aspergillus flavus,OTB和OTD為青霉菌Penicillium infrabuccalum,OTC為木霉菌Trichoderma sp.。生物學特性研究表明4株病原菌在PDA培養(yǎng)基生長良好,適宜溫度為25-30℃;菌株OTA和OTB的最適碳源分別為木糖和葡萄糖,菌株OTC和OTD的最適碳源為果糖和蔗糖;菌株OTA和OTB的最適氮源分別為牛肉膏和尿素,菌株OTC和菌株OTD的最適氮源為NaNO_3和蛋白胨;菌株OTB、OTC和OTD酸性條件生長較好,而pH對OTA的生長影響較小。同時試驗了植物精油成分異硫氰酸烯丙酯對病原菌的抑止效果,結(jié)果表明異硫氰酸烯丙酯對菌株OTA、OTB、OTC和OTD菌絲的生長具有良好的抑制作用,在20μL/L劑量時,對四株菌株的抑制率均超過97%。靈芝三萜是靈芝中的最主要活性成分之一,其含量的高低直接影響到靈芝的質(zhì)量,為了提高靈芝子實體中靈芝三萜的含量,本研究在25℃室溫條件下,分別采用21、40、60、80、100%濃度的氧以1.5mL/min的流速處理靈芝6天,分析高氧處理對采后靈芝子實體中靈芝三萜生物合成、抗氧化及其DNA損傷保護活性的影響,結(jié)果表明,60%氧氣濃度可有效減緩失重速度;高氧調(diào)控利于靈芝總?cè)?黃酮、總酚含量的積累,分別比自然對照組提高了50%-80%;5種三萜單體含量受高氧的影響顯著,含量最高的三萜單體為靈芝酸A,約為最低含量靈芝酸C1的10倍;同時高氧使三萜生物合成關(guān)鍵酶基因表達上調(diào):HMGR(3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶)表達量差異性最為顯著(P0.01),HMGS(3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合成酶)表達量最高,OSC(環(huán)氧鯊烯環(huán)化酶)最低。高氧處理亦明顯促進靈芝子實體的體外抗氧化活性,對ABTS、超氧陰離子及羥基自由基清除率均比對照組有顯著提高。不同濃度氧處理的靈芝子實體對DNA損傷的保護率在30%-65%,60%氧處理3天的樣品具有最高的活性,相較于對照組約上升了1.2倍。因此,高氧處理采后靈芝的最佳條件為60%的氧處理3天。另外,為了增加靈芝三萜化合物的水溶性并在消化液中實現(xiàn)緩釋,本研究采用噴霧干燥法制備了靈芝三萜微膠囊,制備微膠囊的工藝為:芯材與壁材的比例為1:2(m/m),壁材為阿拉伯膠和β-環(huán)糊精,比例為1:1(m/m),進風溫度180℃,流量30ml/min,包埋率可達88.9%。微膠囊化的靈芝三萜釋放情況為:模擬腸液模擬胃液口腔模擬液,腸液中在70min達到最大值87.5%。
【學位授予單位】：溫州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.31;R285.5;R283.6
【圖文】：

圖 2-1 霉變的靈芝子實體ig.2-1 G. lucidum fruiting body infected by pathogenic fu態(tài)學鑒定接種到 PDA 平板上活化后，參考載玻片溫室培溫箱中培養(yǎng) 3-4 天。利用顯微成像系統(tǒng)（BA2、菌絲特征及分支情況等，并拍照。子生物學鑒定 DNA 的提取采用 Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒（參考試劑盒說明書： 真菌孢子粉末，加入 1.5mL 離心管中，加入LBufferPFrpm 離心 5min，LBuffer，充分顛倒混勻L 無水乙醇，

19圖 2-2 病原菌菌株的形態(tài)特征觀察 2-2 An observation on morphological characters of pathogenic fungi strainTD 在 PDA 培養(yǎng)基上生長較為緩慢且易被感染，點狀擴散，黑絲，7 天可長到 2/3，長滿后的菌落致密結(jié)實，有小的球狀隆起小水珠，接觸即可浸濕菌落表面，背面有褶皺，分生孢子梗數(shù)根彎曲，頂端有分枝，較為膨脹，分生孢子聚生于小梗上，呈卵胞，4.5～6.5μm 1.5～2.5μm 無色至淡色透明。依據(jù)病原菌的特征，參考文獻，初步鑒定分離菌株 OTC 為木霉屬，分離菌株屬，分離菌株 OTA 為曲霉。

2-3 ITS1 和 ITS4 區(qū)域的 PCＲ擴增產(chǎn)物電泳lectrophoresis of PCR amplified products in ITS分析TS 區(qū)通用引物 ITS1 和 ITS4，擴增這 400bp 附近有明顯的擴增條帶（圖 2-3，圖菌株 OTB、 marker、菌株 OTC、菌株 原菌 ITS 序列與 GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的A7.0 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 2-MF681598、MH2794 的黃曲霉聚為一支us；OTB、OTD 與 GenBank 中登記的登霉聚為一支，相似度為 99%，確定為 Pen Trichoderma sp.。

【參考文獻】

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本文編號：2779340