【摘要】：目的:腦卒中(cerebral stroke)是臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病,是目前臨床上三大致死疾病之一,也是首位致殘因素。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中,其中缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke)占全部腦卒中的60%~80%,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,已成為醫(yī)藥學(xué)界的熱點(diǎn)研究課題。缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明確,亦無(wú)療效確切的治療藥物。因此,國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直致力于尋找能夠拮抗腦卒中病理過(guò)程的藥物,探索其藥效和作用機(jī)制,以期為治療腦卒中提供新的選擇。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型,以神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分、腦水腫程度、梗死體積百分率、腦組織病理形態(tài)學(xué)變化、腦組織神經(jīng)細(xì)胞及微血管超微結(jié)構(gòu)、血管滲漏程度為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),觀察腦缺血再灌注過(guò)程中胡黃連苷Ⅱ(picroside Ⅱ)拮抗氧化損傷、保護(hù)血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的作用,通過(guò)對(duì)活性氧(reactive oxygen species,ROS)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH氧化酶)及相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè),以及對(duì)血腦屏障相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)的檢測(cè),從細(xì)胞、分子、基因水平探討胡黃連苷Ⅱ?qū)寡趸瘬p傷和保護(hù)血腦屏障的作用及機(jī)制,為胡黃連苷Ⅱ發(fā)展成為治療缺血性卒中的新型腦保護(hù)劑提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。方法:本研究采用經(jīng)典的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,造成大鼠的局灶性腦缺血再灌注損傷。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、局灶性腦缺血再灌注損傷(模型)組、胡黃連苷Ⅱ(治療藥物)組、夾竹桃麻素(陽(yáng)性對(duì)照藥物)組、胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素(共同作用)組。各組于缺血再灌注后腹腔注射給藥,假手術(shù)組和模型組同步給予腹腔注射生理鹽水,共進(jìn)行以下四部分實(shí)驗(yàn):1.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后腦組織的保護(hù)作用主要從藥效學(xué)方面觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫缶衷钚阅X缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。(1)神經(jīng)功能學(xué)評(píng)價(jià):腦缺血2h再灌注22h后,參照改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity score points,mNSS)法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,檢測(cè)動(dòng)物神經(jīng)損傷程度。(2)腦含水量的測(cè)定:采用干濕稱(chēng)重法測(cè)定腦含水量。(3)腦梗死體積的測(cè)定:采用氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色法測(cè)定大鼠腦梗死體積百分比。(4)病理組織學(xué)檢查:腦缺血2h再灌注22h后,將大鼠快速全身灌流固定,斷頭取腦,將大腦皮質(zhì)部位行冠狀切塊,固定過(guò)夜,常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。將蠟塊切成4μm連續(xù)冠狀切片后進(jìn)行蘇木精伊紅(hematoxylin eosine,HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。(5)通過(guò)電鏡觀察大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變:取缺血側(cè)皮層制備1mm×1mm×1mm腦組織,用戊二醛固定24h后,經(jīng)漂洗,鋨酸后固定后,切成50nm超薄切片,于電鏡下觀察。2.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后腦組織的保護(hù)作用機(jī)制(1)ROS含量和NADPH氧化酶活性的檢測(cè):應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)ROS含量和NADPH氧化酶活性。(2)Rac-1、Nox2蛋白表達(dá)的檢測(cè):Western-blot法檢測(cè)Rac-1、Nox2的蛋白表達(dá),一抗分別采用小鼠抗大鼠、兔抗大鼠的單克隆抗體,二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠、羊抗兔的IgG,以β-actin作為內(nèi)參。發(fā)光顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)(Biospectrum 810 Imaging system,UVP,USA)測(cè)定各條帶的灰度值。(3)Rac-1、Nox2 mRNA表達(dá)的檢測(cè):取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)腦組織,用Trizol試劑提取總RNA,取2μg進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),以b-actin作為參照檢測(cè)Rac-1、Nox2 mRNA的表達(dá)。3.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用主要從細(xì)胞水平觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)ρX屏障的保護(hù)作用。(1)通過(guò)電鏡觀察硝酸鑭在毛細(xì)血管的滲漏程度:造模后,靜脈注入0.5ml 2%硝酸鑭-生理鹽水,鑭醛固定液固定,取缺血大腦皮層腦組織,切塊后,經(jīng)固定、切片、干燥后,電鏡觀察BBB超微結(jié)構(gòu)。(2)腦缺血再灌注損傷后,血腦屏障滲漏程度的測(cè)定:應(yīng)用熒光法測(cè)定伊文思藍(lán)的滲漏率。4.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用機(jī)制(1)ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5 mRNA表達(dá)的檢測(cè):分離缺血側(cè)腦組織的皮質(zhì),用Trizol試劑提取總RNA,取2μg進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),以b-actin作為參照檢測(cè)ROCK、MLCK、MMP-2、Claudin-5 mRNA的表達(dá)。(2)ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5蛋白表達(dá)的檢測(cè):Western-blot法檢測(cè)ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5的蛋白表達(dá),一抗分別采用兔抗大鼠、小鼠抗大鼠的單克隆抗體,二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、兔抗小鼠的IgG,以β-actin作為內(nèi)參。發(fā)光顯影,凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶的灰度值。結(jié)果1.胡黃連苷Ⅱ?qū)衷钚阅X缺血再灌注損傷的保護(hù)作用(1)神經(jīng)功能評(píng)分:假手術(shù)組大鼠無(wú)明顯的神經(jīng)功能缺損,模型組大鼠可觀察到明顯的神經(jīng)功能缺陷,與模型組相比,胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分均明顯降低(P值均0.05),且以上三組的mNSS分值無(wú)顯著性差異(P0.05)。(2)腦梗死體積及含水量的測(cè)定:假手術(shù)組大鼠的腦組織無(wú)明顯梗死灶,模型組出現(xiàn)白色大面積梗死灶(P0.01)。雙側(cè)大腦半球不對(duì)稱(chēng),左側(cè)大腦半球有明顯的水腫表現(xiàn)。胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組與模型組相比,梗死體積均有明顯的降低(P值均0.01)。胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組的腦梗死體積與胡黃連苷Ⅱ組相比,亦有明顯的降低(P0.05),說(shuō)明兩藥在降低腦梗死體積方面有一定的協(xié)同作用;胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組的腦水腫程度和腦含水量與模型組相比也有明顯的降低。從降低腦梗死體積和腦水腫程度方面來(lái)評(píng)價(jià),20mg/kg劑量的胡黃連苷Ⅱ與50mg/kg劑量的夾竹桃麻素相比,效果相當(dāng)。對(duì)于降低腦梗死體積程度,兩藥協(xié)同具有更顯著的作用。(3)病理組織學(xué)檢查:假手術(shù)組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞分布均勻,排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,著色均勻。模型組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核固縮、著色加深,變形壞死后形成大量空泡。胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組、胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組大鼠神經(jīng)細(xì)胞分布較均勻,排列較規(guī)整,輪廓尚清晰,結(jié)構(gòu)較完整,著色均勻,此三組的變性細(xì)胞指數(shù)(denatured cells index,DCI)較模型組顯著降低(P0.05),但此三組的DCI之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。(4)應(yīng)用電鏡觀察大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變:假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)清晰完整,模型組神經(jīng)元以及細(xì)胞器各結(jié)構(gòu)均有皺縮、松散,損傷明顯。胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組細(xì)胞皺縮、細(xì)胞器損傷均明顯減輕。2.胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血再灌注保護(hù)作用機(jī)制(1)大鼠大腦皮質(zhì)組織中ROS產(chǎn)量和NADPH氧化酶活性的檢測(cè):與假手術(shù)組相比,模型組大鼠大腦皮質(zhì)組織中ROS產(chǎn)量顯著增加(P0.001),NADPH氧化酶活性明顯升高(P0.001),而胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組均明顯降低了ROS含量和NADPH氧化酶活性(P值均0.01),且以上三組在降低ROS產(chǎn)量和NADPH氧化酶活性方面無(wú)顯著性差異(P0.05)。(2)Rac-1和Nox2蛋白表達(dá)的檢測(cè):與假手術(shù)組相比,模型組大鼠大腦皮質(zhì)組織中Rac-1和Nox2蛋白表達(dá)明顯升高(P值均0.01),而胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組均能明顯降低Rac-1和Nox2蛋白的表達(dá)(P值均0.01),且以上三組在降低Rac-1和Nox2蛋白的表達(dá)方面無(wú)顯著性差異(P0.05)。(3)Rac-1和Nox2的mRNA表達(dá)的檢測(cè):假手術(shù)組僅有少量Rac-1和Nox2的m RNA的表達(dá)。與假手術(shù)組相比,模型組的mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P值均0.01),而胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組均可降低Rac-1和Nox2的mRNA的表達(dá)(P值均0.05),且以上三組在降低Rac-1和Nox2的m RNA的表達(dá)方面無(wú)顯著性差異(P0.05)。3.胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用(1)通過(guò)電鏡觀察硝酸鑭在腦毛細(xì)血管中的滲出情況:假手術(shù)組血管結(jié)構(gòu)完整,硝酸鑭均在血管腔內(nèi),沒(méi)有滲出至血管外側(cè)。模型組毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)被破壞,通透性增大,硝酸鑭滲出至毛細(xì)血管外組織間隙中。胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組的硝酸鑭聚集在管腔內(nèi)側(cè)的緊密連接處,并未滲出至血管外側(cè)的組織間隙中,腦毛細(xì)血管的損傷明顯減輕。(2)腦組織中EB的含量測(cè)定:假手術(shù)組大鼠腦內(nèi)幾乎無(wú)EB滲出。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦組織的EB含量顯著升高(P0.001),表明血腦屏障損傷嚴(yán)重。胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組均可顯著減少腦組織中EB含量(P值均0.01),且以上三組的EB含量無(wú)顯著性差異(P0.05)。4.胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用機(jī)制(1)ROCK、MLCK、MMP-2和Claudin-5的mRNA表達(dá)的檢測(cè):假手術(shù)組僅有少量ROCK、MLCK和MMP-2的mRNA表達(dá),而模型組的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P值均0.05),胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組均可明顯降低ROCK、MLCK和MMP-2的mRNA的表達(dá)(P值均0.05),且以上三組在降低ROCK、MLCK、MMP-2的mRNA的表達(dá)方面無(wú)顯著性差異(P0.05)。Claudin-5m RNA在假手術(shù)組有大量表達(dá),在模型組大鼠大腦皮質(zhì)組織中表達(dá)明顯降低(P0.01),胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組均能明顯提高Claudin-5的m RNA表達(dá)(P值均0.05),且以上三組在提高Claudin-5的m RNA的表達(dá)方面無(wú)顯著性差異(P0.05)。(2)ROCK、MLCK、MMP-2、Claudin-5蛋白表達(dá)的檢測(cè):ROCK、MLCK和MMP-2蛋白在假手術(shù)組僅有少量表達(dá),模型組大鼠腦組織中此三種蛋白的表達(dá)均有顯著增加(P值均0.01),胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組此三種蛋白的表達(dá)均明顯降低(P值均0.05),且以上三組在降低ROCK、MLCK、MMP-2的蛋白表達(dá)方面無(wú)顯著性差異(P0.05)。Claudin-5在假手術(shù)組有大量表達(dá),在模型組大鼠大腦皮質(zhì)組織中表達(dá)明顯降低(P0.01),胡黃連苷Ⅱ組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷Ⅱ+夾竹桃麻素組均能明顯提高Claudin-5的蛋白表達(dá)(P值均0.05),且以上三組在提高Claudin-5的蛋白表達(dá)方面無(wú)顯著性差異(P0.05)。結(jié)論1.胡黃連苷Ⅱ能夠改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)行為功能、降低腦含水量和腦梗死體積,保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞,對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。2.胡黃連苷Ⅱ可能通過(guò)降低腦組織中ROS的產(chǎn)量、抑制NADPH氧化酶的活性、降低Rac-1和Nox2的mRNA和蛋白的表達(dá)而提高腦組織的抗氧化能力,減輕ROS介導(dǎo)的腦組織損傷,從而對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。3.胡黃連苷Ⅱ能明顯減輕腦毛細(xì)血管的損傷,減少硝酸鑭顆粒和伊文思藍(lán)從腦毛細(xì)血管滲漏至腦組織間隙,對(duì)腦缺血再灌注后血腦屏障有明顯的保護(hù)作用。4.胡黃連苷Ⅱ可能通過(guò)抑制ROCK、MLCK、MMP-2的mRNA和蛋白的表達(dá),增強(qiáng)Claudin-5的mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)血腦屏障的作用。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

手術(shù)大鼠經(jīng)胡黃連苷II治療后，其mNSS評(píng)分明顯低于模型組（P<0桃麻素組、胡黃連苷 II+夾竹桃麻素組的評(píng)分亦明顯低于模型組（P<0.05治療前后，胡黃連苷 II 組、夾竹桃麻素組以及胡黃連苷 II+夾竹桃麻素組mNSS 評(píng)分均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這提示胡黃連苷 II 與夾竹桃麻素在改鼠神經(jīng)行為功能方面并沒(méi)有協(xié)同作用。（見(jiàn)圖 1.1）

組織會(huì)被染成深紅色，而缺血梗塞組織，因其線粒體損傷，脫氫酶活力喪失，不能將TTC還原成TPF，因而梗死灶呈現(xiàn)蒼白色。方差分析顯示，各組實(shí)驗(yàn)大鼠的腦梗死體積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），Bonferroni(B)法兩兩比較顯示：如圖1.2A、1.2B所示，假手術(shù)組大鼠腦組織呈均勻的紅色，未見(jiàn)明顯梗死灶。模型組大鼠可見(jiàn)大片白色梗死灶（34.75± 4.23%）。胡黃連苷II組、夾竹桃麻素組、胡黃連苷II+夾竹桃麻素組大鼠腦梗死體積（14.12±1.73%, 13.68±1.38%, 4.57±0.62%）均較模型組明顯縮�。≒<0.05），胡黃連苷II+夾竹桃麻素共同作用組腦梗死體積較胡黃連苷II單獨(dú)做用組明顯縮�。≒<0.05）。胡黃連苷II治療組與夾竹桃麻素陽(yáng)性對(duì)照藥物組比較，兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

BTTC染色各組大鼠腦梗死體積百分率

【參考文獻(xiàn)】

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1 王粵;宿希;逄芳芳;常翠翠;裴海濤;郭云良;;胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫笕毖X組織神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100B和髓鞘堿性蛋白表達(dá)的影響[J];中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué);2013年05期

2 ;Relationship of gelatinases-tight junction proteins and blood-brain barrier permeability in the early stage of cerebral ischemia and reperfusion[J];Neural Regeneration Research;2012年31期

3 李紅云;趙麗;宿希;裴海濤;張美增;辛輝;郭云良;;胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血/再灌注損傷劑量和時(shí)間窗的初步探討[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2012年04期

4 孫麗;王嶺;房雷;高煥民;李震;李曉丹;周鎮(zhèn);;胡黃連苷Ⅱ在腦缺血再灌注損傷中抗氧化作用的研究[J];國(guó)際中醫(yī)中藥雜志;2011年09期

5 郭云良;沈衛(wèi);杜芳;李琴;李震;;胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血再灌注損傷后TLR4及NFκB表達(dá)的影響[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志;2011年01期

6 趙多明;張梓倩;段云霞;張本忠;劉慶山;;胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷的保護(hù)作用研究[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2010年06期

7 李婷婷;彭軍;;次氯酸介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及其病理生理學(xué)意義[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2010年04期

8 李琴;郭云良;李震;徐新穎;;胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血/再灌注損傷Caspase-3和PARP表達(dá)的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2010年03期

9 顧學(xué)蘭,丁新生,狄晴,趙忠新,陳家慧,李健華;依達(dá)拉奉注射液治療急性腦梗死的臨床療效評(píng)價(jià)[J];中國(guó)新藥與臨床雜志;2005年02期

10 殷克敬;腦血管病早期針灸治療與早期康復(fù)醫(yī)療的反思[J];陜西中醫(yī)函授;2001年05期

本文編號(hào)：2777674