【摘要】：目的:基于“腎主骨”理論對骨質(zhì)增生止痛丸的生物學機制進行分析。方法:從細胞水平和動物水平對骨質(zhì)增生止痛丸的生物學機制進行深入研究。通過RNA-seq高通量測序技術建立骨質(zhì)增生止痛丸作用后的原代軟骨細胞及腎臟組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,結合生物信息學分析方法,對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行差異基因表達分析,功能注釋及代謝通路分析,挖掘基于“腎主骨”理論的骨質(zhì)增生止痛丸的生物學機制。結果:1.CCK-8實驗結果表明骨質(zhì)增生止痛丸能夠顯著促進原代軟骨細胞增殖,且呈現(xiàn)一定的量效關系。骨質(zhì)增生止痛丸在0.8 mg/ml和1.0 mg/ml濃度時對軟骨細胞的促增殖活性最佳,效果基本相同。2.構建了骨質(zhì)增生止痛丸作用后的小鼠原代軟骨細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,通過生物信息學分析共鑒定出229個差異表達基因,其中骨質(zhì)增生止痛丸處理組顯著上調(diào)的基因139個,顯著下調(diào)的基因90個。GO功能富集分析結果表明骨質(zhì)增生止痛丸主要通過應激反應的調(diào)節(jié)、免疫應答調(diào)節(jié)、多細胞組織過程的調(diào)節(jié)以及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)實現(xiàn)對原代軟骨細胞的調(diào)控作用。KEGG代謝通路富集分析結果表明骨質(zhì)增生止痛丸通過參與TNF信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路的調(diào)節(jié)對原代軟骨細胞進行調(diào)控。在骨質(zhì)增生止痛丸的作用下,小鼠軟骨細胞中10種具有正向調(diào)節(jié)細胞增殖作用的基因表達水平呈上調(diào)趨勢,包括Tnfaip2、Chi311、Tnf、Pfkfb3、Sox8、Jag1、Mafb、Pla2g7、Hnrnpa1和E2f3,7種具有負向調(diào)節(jié)細胞增殖作用基因的表達水呈下調(diào)趨勢,包括Rhob、Dusp6、Plk3、Fgf21、Rad9a、Filip1l和Rasl11b。此外,骨質(zhì)增生止痛丸可以提高Sox9、Sox5、Sox6、Acan、Col2a1、Col9a1、Col11a1、Hapln1和Wwp2在內(nèi)的9種軟骨發(fā)育早期成軟骨標志物的基因表達水平。3.構建了骨質(zhì)增生止痛丸作用后的大鼠腎臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,通過生物信息學分析共鑒定出709個差異表達基因,其中骨質(zhì)增生止痛丸處理組顯著上調(diào)的基因255個,顯著下調(diào)的基因454個。GO功能富集分析結果表明骨質(zhì)增生止痛丸主要通過離子轉(zhuǎn)運(尤其是陰離子的轉(zhuǎn)運)、有機酸的轉(zhuǎn)運、細胞外基質(zhì)和結構組織的調(diào)控進而實現(xiàn)對大鼠腎臟功能的調(diào)控。KEGG代謝通路富集分析結果表明骨質(zhì)增生止痛丸通過參與細胞外基質(zhì)受體間相互作用、甲狀腺激素信號通路的調(diào)節(jié)以及PI3K-Akt信號通路的調(diào)節(jié)進一步對大鼠腎臟相關功能進行調(diào)控。在骨質(zhì)增生止痛丸的作用下,大鼠腎臟中3種具有正向調(diào)節(jié)軟骨細胞或細胞外結構的基因表達水平呈上調(diào)趨勢,包括Ucma、Scin和Cited1,13種具有負向調(diào)節(jié)軟骨細胞或細胞外結構的基因表達水呈下調(diào)趨勢,包括Cyp27b1、Igsf10、Adamts4、Nfil3、Maf、Fbn1、Amer1、Gas2、Omd、Bnc2、Fn1、Cilp和Col27a1。結論:骨質(zhì)增生止痛丸能夠以劑量依賴的方式促進原代軟骨細胞增殖,顯著提高軟骨細胞的促增殖活性,同時對軟骨細胞的分化、細胞外基質(zhì)的破壞具有一定的抑制作用。骨質(zhì)增生止痛丸可以通過對腎臟基因的調(diào)控,促進軟骨細胞的增殖與軟骨祖細胞的分化,抑制軟骨細胞的分化,維持軟骨支架的穩(wěn)定,進而參與軟骨形成,保護軟骨結構,實現(xiàn)補腎健骨的功效。
【學位授予單位】：長春中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285
【圖文】：

（3）按照 100 μl/孔將兩組藥物按不同濃度分別加至相應的 96 孔板中對原代軟骨細胞進行干預，輕輕搖勻后轉(zhuǎn)至 5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；（4）取出 96 孔板，在避光條件下向每孔中加入 10 μl Cell Counting Kit-8 試劑，放回至培養(yǎng)箱再次孵育 1 h；（5）再次取出 96 孔板，利用酶標儀震蕩后在 450 nm 處檢測吸光度，按不同濃度 GZZSZTW 和 DAE 給藥后軟骨細胞的存活率計算軟骨細胞增殖率。3 實驗結果3.1 原代軟骨細胞的提取分離在倒置顯微鏡的觀察下可見，從 C57BL/6J 乳鼠肋軟骨中分離出的原代軟骨細胞在溶液中呈晶瑩的顆粒狀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 5 h 后，軟骨細胞大部分完成貼壁，貼壁后的軟骨細胞呈多角形，培養(yǎng) 24 h 時后，軟骨細胞依然保持良好的生物活性。

長春中醫(yī)藥大學 2019 屆博士學位論文之增加，最高增殖活性均保持在 110%以上。其中，在骨質(zhì)增生止痛丸提取物的作用下，軟骨細胞的增殖活性從 0.8 mg/ml 的藥物濃度時開始趨于平緩，與 1mg/ml 濃度的作用近乎平行；而在鹿茸提取物的作用下，軟骨細胞的增殖活性從0.6 mg/ml 濃度時開始趨于平緩，同 0.8 mg/ml 的濃度以及 1 mg/ml 濃度的增殖作用幾近相同。骨質(zhì)增生止痛丸提取物在 0.8 mg/ml 的藥物濃度表現(xiàn)出的增殖作用與鹿茸提取物在 1 mg/ml 濃度下的作用幾近相同。

TW 組和 BLANK 組原代軟骨細胞總 RN止痛丸處理組，B 代表空白組，Marker g Buffer，電泳時間 10 min。和 BLANK 組原代軟骨細胞總 RNA 紫外BLANK 88.25 1.89 50 平臺測序和數(shù)據(jù)過濾處理后，對過

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本文編號：2777089