【摘要】：目的:基于“腎主骨”理論對骨質(zhì)增生止痛丸的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行分析。方法:從細(xì)胞水平和動物水平對骨質(zhì)增生止痛丸的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行深入研究。通過RNA-seq高通量測序技術(shù)建立骨質(zhì)增生止痛丸作用后的原代軟骨細(xì)胞及腎臟組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,結(jié)合生物信息學(xué)分析方法,對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因表達(dá)分析,功能注釋及代謝通路分析,挖掘基于“腎主骨”理論的骨質(zhì)增生止痛丸的生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果:1.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明骨質(zhì)增生止痛丸能夠顯著促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞增殖,且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。骨質(zhì)增生止痛丸在0.8 mg/ml和1.0 mg/ml濃度時對軟骨細(xì)胞的促增殖活性最佳,效果基本相同。2.構(gòu)建了骨質(zhì)增生止痛丸作用后的小鼠原代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,通過生物信息學(xué)分析共鑒定出229個差異表達(dá)基因,其中骨質(zhì)增生止痛丸處理組顯著上調(diào)的基因139個,顯著下調(diào)的基因90個。GO功能富集分析結(jié)果表明骨質(zhì)增生止痛丸主要通過應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、多細(xì)胞組織過程的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對原代軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用。KEGG代謝通路富集分析結(jié)果表明骨質(zhì)增生止痛丸通過參與TNF信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路的調(diào)節(jié)對原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。在骨質(zhì)增生止痛丸的作用下,小鼠軟骨細(xì)胞中10種具有正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖作用的基因表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢,包括Tnfaip2、Chi311、Tnf、Pfkfb3、Sox8、Jag1、Mafb、Pla2g7、Hnrnpa1和E2f3,7種具有負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖作用基因的表達(dá)水呈下調(diào)趨勢,包括Rhob、Dusp6、Plk3、Fgf21、Rad9a、Filip1l和Rasl11b。此外,骨質(zhì)增生止痛丸可以提高Sox9、Sox5、Sox6、Acan、Col2a1、Col9a1、Col11a1、Hapln1和Wwp2在內(nèi)的9種軟骨發(fā)育早期成軟骨標(biāo)志物的基因表達(dá)水平。3.構(gòu)建了骨質(zhì)增生止痛丸作用后的大鼠腎臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,通過生物信息學(xué)分析共鑒定出709個差異表達(dá)基因,其中骨質(zhì)增生止痛丸處理組顯著上調(diào)的基因255個,顯著下調(diào)的基因454個。GO功能富集分析結(jié)果表明骨質(zhì)增生止痛丸主要通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)(尤其是陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn))、有機(jī)酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)構(gòu)組織的調(diào)控進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對大鼠腎臟功能的調(diào)控。KEGG代謝通路富集分析結(jié)果表明骨質(zhì)增生止痛丸通過參與細(xì)胞外基質(zhì)受體間相互作用、甲狀腺激素信號通路的調(diào)節(jié)以及PI3K-Akt信號通路的調(diào)節(jié)進(jìn)一步對大鼠腎臟相關(guān)功能進(jìn)行調(diào)控。在骨質(zhì)增生止痛丸的作用下,大鼠腎臟中3種具有正向調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢,包括Ucma、Scin和Cited1,13種具有負(fù)向調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)水呈下調(diào)趨勢,包括Cyp27b1、Igsf10、Adamts4、Nfil3、Maf、Fbn1、Amer1、Gas2、Omd、Bnc2、Fn1、Cilp和Col27a1。結(jié)論:骨質(zhì)增生止痛丸能夠以劑量依賴的方式促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞增殖,顯著提高軟骨細(xì)胞的促增殖活性,同時對軟骨細(xì)胞的分化、細(xì)胞外基質(zhì)的破壞具有一定的抑制作用。骨質(zhì)增生止痛丸可以通過對腎臟基因的調(diào)控,促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖與軟骨祖細(xì)胞的分化,抑制軟骨細(xì)胞的分化,維持軟骨支架的穩(wěn)定,進(jìn)而參與軟骨形成,保護(hù)軟骨結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)補(bǔ)腎健骨的功效。
【學(xué)位授予單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285
【圖文】：

（3）按照 100 μl/孔將兩組藥物按不同濃度分別加至相應(yīng)的 96 孔板中對原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，輕輕搖勻后轉(zhuǎn)至 5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；（4）取出 96 孔板，在避光條件下向每孔中加入 10 μl Cell Counting Kit-8 試劑，放回至培養(yǎng)箱再次孵育 1 h；（5）再次取出 96 孔板，利用酶標(biāo)儀震蕩后在 450 nm 處檢測吸光度，按不同濃度 GZZSZTW 和 DAE 給藥后軟骨細(xì)胞的存活率計(jì)算軟骨細(xì)胞增殖率。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 原代軟骨細(xì)胞的提取分離在倒置顯微鏡的觀察下可見，從 C57BL/6J 乳鼠肋軟骨中分離出的原代軟骨細(xì)胞在溶液中呈晶瑩的顆粒狀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 5 h 后，軟骨細(xì)胞大部分完成貼壁，貼壁后的軟骨細(xì)胞呈多角形，培養(yǎng) 24 h 時后，軟骨細(xì)胞依然保持良好的生物活性。

長春中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆博士學(xué)位論文之增加，最高增殖活性均保持在 110%以上。其中，在骨質(zhì)增生止痛丸提取物的作用下，軟骨細(xì)胞的增殖活性從 0.8 mg/ml 的藥物濃度時開始趨于平緩，與 1mg/ml 濃度的作用近乎平行；而在鹿茸提取物的作用下，軟骨細(xì)胞的增殖活性從0.6 mg/ml 濃度時開始趨于平緩，同 0.8 mg/ml 的濃度以及 1 mg/ml 濃度的增殖作用幾近相同。骨質(zhì)增生止痛丸提取物在 0.8 mg/ml 的藥物濃度表現(xiàn)出的增殖作用與鹿茸提取物在 1 mg/ml 濃度下的作用幾近相同。

TW 組和 BLANK 組原代軟骨細(xì)胞總 RN止痛丸處理組，B 代表空白組，Marker g Buffer，電泳時間 10 min。和 BLANK 組原代軟骨細(xì)胞總 RNA 紫外BLANK 88.25 1.89 50 平臺測序和數(shù)據(jù)過濾處理后，對過

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本文編號：2777089