【摘要】：背景與目的:骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨吸收增強(qiáng)而骨形成緩慢為特征的一種骨代謝障礙疾病。目前,臨床在用的一些抗骨質(zhì)疏松藥物,盡管有些藥物療效顯著,但也出現(xiàn)副作用明顯,或長(zhǎng)期療效還不明確,或價(jià)格昂貴造成患者依從性低等缺點(diǎn)。尋找一種天然,安全有效的植物化學(xué)物較為不錯(cuò)的選擇。課題組前期研究顯示黃精多糖(Polygonatum Sibiricum Polysaccharide,PSP)能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化,具體機(jī)制是PSP通過(guò)影響Wnt/β-catenin通路中下游效應(yīng)分子β-catenin表達(dá)和入核從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,但不通過(guò)該通路的上游LRP5分子激活途徑。我們推測(cè)可能存在其它途徑或者信號(hào)通路參與了PSP促進(jìn)BMSCs的成骨分化。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)探究PSP對(duì)去卵巢大鼠的抗骨質(zhì)疏松作用;更進(jìn)一步探究PSP在體外促進(jìn)BMSCs成骨分化的作用以及可能分子機(jī)制,為PSP抗骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.去卵巢法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型。(1)所有大鼠以體重匹配,按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組,包括高、中劑量黃精多糖組(H-PSP、M-PSP),唑來(lái)膦酸鹽組(ZOL),模型組(OVX)和假手術(shù)組(SHAM);(2)各組大鼠隔天灌胃,每周測(cè)量體重;(3)PSP干預(yù)12周,收集大鼠子宮并稱(chēng)重;(4)Micro-CT脛骨掃描,行骨密度(BMD)以及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析,包括:骨小粱數(shù)量(Tb.N)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV\TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小粱分離度(Tb.Sp)等指標(biāo);(5)HE染色行骨組織病理學(xué)觀察;(6)Real-time PCR分析大鼠骨組織中與成骨破骨分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)。2.建立BMSCs細(xì)胞模型。(1)BMSCs培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和變化;(2)PSP處理BMSCs 24h,48h,72h后CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖;(3)PSP成骨誘導(dǎo)BMSCs 7天和28天后,堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色并定量分析,Real-time PCR分析成骨分化關(guān)鍵基因(ALP、Runx2、OCN)mRNA的表達(dá);(4)PSP處理BMSCs后24h,48h,72h后Real-time PCR分析Hippo通路相關(guān)基因(MST1、TAZ)mRNA的相對(duì)表達(dá),Western-blot檢測(cè)Hippo通路相關(guān)蛋白(MST1、p-MST1、TAZ、p-TAZ)的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)0周時(shí)各組大鼠體重之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,12周時(shí)模型組大鼠體重較假手術(shù)組增加明顯,唑來(lái)膦酸鹽和PSP各劑量組大鼠體重較模型組顯著降低;(2)12周時(shí)假手術(shù)組大鼠子宮形態(tài)正常,去卵巢大鼠各組子宮呈不同程度萎縮,與模型組子宮濕重相比,PSP各劑量組均無(wú)顯著性差異,而唑來(lái)膦酸鹽組子宮濕重增加顯著;(3)與假手術(shù)組相比,模型組大鼠骨密度,骨體積分?jǐn)?shù),骨小梁數(shù)量較假手術(shù)組降低明顯,而骨小梁分離度增加明顯;與模型組相比,唑來(lái)膦酸鹽和PSP各劑量組大鼠骨密度,骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)量顯著增加,而骨小梁分離度顯著降低,但各組骨小梁厚度之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(4)HE染色顯示假手術(shù)組骨小梁結(jié)構(gòu)正常,致密,連續(xù),間隙正常,充滿(mǎn)大量骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,而去卵巢組大鼠骨小梁數(shù)量呈不同程度降低和破壞,間隙增大,模型組和中劑量PSP組骨小梁破壞明顯;(5)骨組織Real-time PCR分析顯示,模型組成骨(ALP、Col1a1、Runx2、OCN)和破骨(ACP5、CTSK)分化相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)較假手術(shù)組顯著增強(qiáng);與模型組相比,高劑量PSP能明顯促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因表達(dá),抑制了破骨分化相關(guān)基因表達(dá),唑來(lái)膦酸鹽組能明顯抑制破骨分化相關(guān)基因表達(dá)而對(duì)成骨分化相關(guān)基因無(wú)影響;(6)P6代BMSCs為長(zhǎng)梭形,細(xì)胞突觸較長(zhǎng),呈集落生長(zhǎng),長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)為旋渦狀,經(jīng)成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞變?yōu)槎趟笮?細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黑色顆粒增多;(7)CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示PSP(0-50mg/L)濃度在24h,48h,72h時(shí)均不影響細(xì)胞增殖;(8)分別行7天和28天成骨誘導(dǎo),堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色顯示各濃度組PSP處理均能促進(jìn)BMSCs的成骨分化和礦化,且25mg/L PSP組作用最明顯;與對(duì)照相比,25 mg/L PSP能明顯促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因(ALP、Runx2、OCN)表達(dá);(9)25 mg/L PSP分別誘導(dǎo)BMSCs 24h,48h,72h,Real-time PCR分析顯示PSP在48h時(shí)能促進(jìn)TAZ基因表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而對(duì)MST1基因表達(dá)無(wú)影響;Western-blot檢測(cè)顯示PSP在48h和72h能明顯抑制TAZ磷酸化,阻止了TAZ的降解,而對(duì)MST1蛋白表達(dá)無(wú)影響。結(jié)論:(1)去卵巢12周的大鼠體重增加加快、子宮萎縮明顯,骨密度和骨量下降明顯,骨微結(jié)構(gòu)破壞。(2)PSP在體內(nèi)能發(fā)揮骨質(zhì)疏松癥的防治作用,能阻止去卵巢大鼠的骨密度下降,骨量丟失和骨微結(jié)構(gòu)破壞。(3)PSP在體外促進(jìn)BMSCs成骨分化時(shí)不影響其細(xì)胞增殖。(4)PSP能夠促進(jìn)BMSCs成骨分化和礦化并促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因(ALP、Runx2、OCN)表達(dá)。(5)PSP促進(jìn)BMSCs成骨分化的機(jī)制可能與Hippo信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5;R-332
【圖文】：

黃精多糖體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松作用及體外促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的實(shí)2 結(jié) 果2.1 黃精多糖對(duì)大鼠體重的影響大鼠術(shù)前稱(chēng)重，此時(shí)記為 0 周，在術(shù)后一周時(shí)間為 12 周，各組大鼠每周統(tǒng)一進(jìn)行稱(chēng)重。藥物變化（圖 1.A），其中模型組大鼠體重增長(zhǎng)速度明重增長(zhǎng)正常，其他組體重增長(zhǎng)速度有所減緩并逐各組間大鼠體重?zé)o明顯差異（P＞0.05），12 周時(shí)組大鼠體量增加明顯(P＜0.01)；黃精多糖各劑量重與模型組相比顯著下降(P<0.05)（圖 1.B）。這些因去卵巢引起的大鼠體重過(guò)快增長(zhǎng)。

between SD rats at 0 and 12 weeks.(*p＜0.05,***p＜0.0012.2 黃精多糖對(duì)去卵巢大鼠子宮的影響藥物干預(yù) 12 周后，大鼠行 3%戊巴比妥鈉腹腔注腔取出各組子宮，剝離干凈子宮表面的附帶物，并拍照鼠子宮充盈、無(wú)萎縮、形態(tài)正常，而去卵巢大鼠各組子縮，其中 OVX 組大鼠子宮萎縮最明顯，各組大鼠子宮大鼠子宮濕重比較，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；較模型組相比，12 周藥物干間子宮濕重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義(P>0.05)，而唑來(lái)膦增加(P<0.05)（圖 2.B）。這些結(jié)果證明黃精多糖對(duì)去卵影響。

SD rats’ uterus in different groups. Bfrom different groups.(*p＜0.05,***p＜2.3 黃精多糖對(duì)去卵巢大鼠骨密度的12 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉處死大鼠鼠骨頭上的肌肉、軟骨等組織，并用鼠左脛骨統(tǒng)一進(jìn)行 Micro-CT 掃描，其掃描區(qū)域，將掃描圖像進(jìn)行三維重構(gòu)度下降了 63%，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義多糖組和唑來(lái)膦酸鹽組骨密度有所增有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中劑量黃精多學(xué)意義(P>0.05)（圖 3）。這些結(jié)果證明密度。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2776676